mStrawberry OP9 cellen zorgen voor volledige evaluatie van alle ES-afgeleide nakomelingen van co-cultuur.
De in vitro differentiatie van embryonale stamcellen tot een lot van hematopoietische cellen is nuttig bij het bestuderen van celpopulaties die moeilijk toegang in vivo en voor het karakteriseren van de vroegste genen die betrokken zijn bij hematopoiese, zonder dat te maken met embryonale letaliteit. De ES/OP9 co-cultuur systeem is oorspronkelijk ontworpen om hematopoietische nakomelingen te produceren, zonder dat de overproductie van macrofagen, zoals de OP9 stromale cellijn is afgeleid van de Calvaria van osteopetrose mutante muizen dat het gebrek aan functionele M-CSF. De in vitro ES/OP9 co-cultuur systeem kan worden gebruikt om de vroege hematopoietische ontwikkeling samenvatten. Wanneer gekweekt op OP9 stromale cellen, ES-cellen differentiëren tot Flk-1 + hemangioblasts, hematopoëtische voorlopercellen, en tenslotte volwassen, terminaal gedifferentieerde lijnen. De standaard ES/OP9 co-cultuur protocol omvat de plaatsing van ES-cellen op een confluente laag OP9 cellen, evenals, periodieke replating stappen om oude te verwijderen, besmetten OP9 cellen. Bovendien, de huidige protocollen betrekking hebben op de evaluatie van alleen de hematopoietische cellen in suspensie en zijn niet geoptimaliseerd voor de evaluatie van ES-afgeleid nakomelingen op elke dag van differentiatie. Echter, met replating stappen en de oogst van slechts een suspensie cellen mist mogelijk een groot deel van ES-afgeleid nageslacht en het ontwikkelen van hematopoietische cellen. Deze kwestie wordt van belang aan te pakken wanneer het proberen om hematopoietische afwijkingen geassocieerd met knock-out-ES lijnen karakteriseren. Hier beschrijven we een gemodificeerde ES / mStrawberry OP9 co-cultuur, die zorgt voor de verwijdering van vervuilende OP9 cellen van stroomafwaarts assays. Deze methode maakt het mogelijk om volledige evaluatie van alle ES-afgeleide nakomelingen op alle dagen van co-cultuur, wat resulteert in een hematopoietische differentiatie patroon, die meer direct overeenkomt met de hematopoietische differentiatie patroon waargenomen binnen de embryo.
Een goede differentiatie van ES-cellen op de samenvloeiing laag van mStrawberry OP9 cellen resulteert in de productie van Flk1 + hemangioblasts op dag vijf van co-cultuur. Hemangioblasts moeten als opgestapeld kransen van cellen, zoals waargenomen in figuur 1. Voor de rest van de co-cultuur, moet zichtbaar ES-afgeleide nageslacht verschijnen als clusters van hematopoietische cellen (figuur 1). Bij Day6 / 7 twee tot vier cel-clusters moeten verschijnen en uitgroeien tot grotere cel clusters (zowel aanhanger en in suspensie), op dag 8 / 9 van de co-cultuur. Andere ES afgeleid nakomelingen zijn ook gevonden handen en voeten gebonden in de klevende stromale cellen laag.
Hoewel niet opgenomen in het protocol, is het essentieel om te pre-testen van de FBS gebruikt in de ES groeimedium, de mStrawberry OP9 groei media en de ES / mStrawberry OP9 differentiatie media. Goed getest serum moeten een goede groei van mStrawberry OP9 cellen, maar ook, een goede differentiatie van embryonale stamcellen in co-cultuur zorgen tot Dag 5 van differentiatie. Als alternatief of in aanvulling op mStrawberry OP9 cellen, kan OP9 cellen worden bestraald, op 8000 rad, voorafgaand aan zaaien bij confluentie (7.8×10 4 cellen / cm 2). Bestraling van OP9 cellen die zorgt voor de eliminatie van herhaalde replating stappen, maar ook, zorgt voor bijna volledige eliminatie van oude, vervuilende OP9 cellen van stroomafwaarts assays.
OP9 cellen werden ontworpen om mStrawberry eiwit tot expressie door transduceren OP9 cellen met 3ug/mL van een lentivirale vector die mStrawberry onder de controle van een CMV-promoter (pRRLsin-CMV vector, UCLA vector kern).
Standaard ES/OP9 co-cultuur protocollen leiden tot de plaatsing van ES-cellen op een confluente laag OP9 cellen, evenals, een dag vijf replating stap om te verminderen oude, vervuilende OP9 cellen van cel-passage. Daarnaast worden alleen hematopoietische cellen in suspensie verwijderd voor de evaluatie van ES-afgeleid nageslacht. Echter, met zowel een replating stap en de oogst van slechts een suspensie cellen mist mogelijk een aanzienlijk aantal van de zich ontwikkelende ES-afgeleide hematopoietische cellen. Deze kwestie wordt van belang aan te pakken wanneer het proberen om hematopoietische afwijkingen geassocieerd met knock-out-ES lijnen karakteriseren. Om dit probleem te omzeilen ons lab gebruikt een aangepaste co-cultuur, door het gebruik van mStrawberry-expressie OP9 cellen. Dit zorgt ervoor dat alle ES nakomelingen worden overgebracht naar de voortdurende co-cultuur op dag 5, en voor de oogst van alle ES-afgeleid nageslacht voor downstream-assays. Deze wijziging zorgt voor een handige tools bij de evaluatie en karakterisering van hematopoietische nakomelingen van zowel mens en muis ES lijnen.
Deze ES-mStrawberry OP9 co-cultuur model recapituleert de verschillende stadia primitieve en definitieve hematopoiese. Bij het bestuderen van de vroegste stadia van hematopoietische ontwikkeling, veel mensen gebruik maken van de BL-CFC (Blast-achtige kolonievormende cel) test, die de ontwikkeling van de hemangioblast uit de ES-cel te beoordelen. Terwijl de BL-CFC-test is een nuttig hulpmiddel bij het onderzoek naar vroege hematopoietische ontwikkeling, de mStrawberry-ES co-cultuur systeem vertoont te verhogen nut als het staat voor de beoordeling van hemangioblast, evenals, meer volwassen hematopoietische geslachten.
Eerdere werk met behulp van traditionele OP9/ES en EB differentiatie protocollen heeft aangetoond dat andere factoren misschien wel nodig zijn, zoals overexpressie van HoxB4, om te leiden op lange termijn repopulatie hematopoietische stamcellen in vitro. Meerwerk is nodig om te beoordelen of mStrawberry negatief, gesorteerd ES-afgeleide populaties waar hematopoietische stamcellen bevatten.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken U. Ganapati voor het opzetten en testen van de mStrawberry OP9 cellijn. Bovendien, wij danken H. Shafifor haar hulp bij de co-cultuur. HP wordt ondersteund door een beurs van de National Heart, Lung, and Blood Institute (F31HL087714) (HP). De inhoud van dit werk is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteur en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Heart, Lung, and Blood Institute of van de National Institutes of Health (NIH). De UCLA Flow Cytometry Core Facility wordt ondersteund door het NIH (CA-16042-en AI-28697), de Jonsson Cancer Center, het UCLA Aids Institute, en de UCLA School of Medicine.
OP-9 Cell Maintenance Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Omega Scientific | FB01 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-C I | 200nM |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |
ES/OP-9 Cell Differentiation Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Hyclone | SH30070 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200mM |
PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-031-CV | |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |