mStrawberry OP9 세포가 공동 문화의 모든 ES – 파생 자손의 완전한 평가를 위해 수 있습니다.
생체내 및 배아 lethalities 처리하지 않고, 조혈에 관련된 최초의 유전자를 특성화에 대한 액세스하기 어렵습니다 세포 인구를 공부하면 조혈 세포의 운명으로 ES 세포의 체외에서 차별에 유용합니다. OP9 stromal 세포 라인 M – CSF 기능 부족 osteopetrosis 돌연변이 생쥐의 calvaria에서 파생되는 등 ES/OP9 공동 문화 시스템은 원래, macrophages의 이상 생산하지 않고, 조혈 자손을 생산하도록 설계되었습니다. 체외 ES/OP9 공동 문화 시스템은 초기 조혈 발전을 요점을 되풀이하기 위해 사용할 수 있습니다. OP9 stromal 세포에 교양하면, ES 세포는 Flk – 1 + hemangioblasts, 조혈 progenitors, 마침내 성숙, 말기 차별 lineages로 구분. 표준 ES/OP9 공동 문화 프로토콜 OP9 세포의 합류 계층에 ES 세포의 위치를 알아볼 수, OP9 세포를 오염 오래된 제거하기 위해뿐만 아니라, 정기 replating 단계를 반복합니다. 또한, 현재의 프로토콜은 정지에서 발견은 조혈 세포를 평가 참여하고 분화의 각 하루 ES – 파생 자손의 평가에 최적화된되지 않습니다. 그러나, replating 단계만을 정지 세포의 수확 하나의 가능성이 ES – 파생 자손과 조혈 세포를 개발의 큰 부분을 그리워. 이 문제는 녹아웃 에스 라인과 관련된 조혈 결함을 특성화하려고 할 때 주소로 중요 해지고 있습니다. 여기 하류 assays에서 OP9 세포 오염의 제거를 허용 수정 ES / mStrawberry OP9 공동 문화를 설명합니다. 이 방법은 더 직접적으로 배아 내에서 관찰 조혈성 차별화 패턴에 해당하는 조혈 차별화 패턴의 결과로, 공동 문화의 모든 일에 모든 ES – 파생 자손의 전체 평가 수 있습니다.
공동 문화의 날 5 Flk1 이상 hemangioblasts의 생산에 mStrawberry OP9 세포 결과 합류 레이어에 ES 세포의 적절한 분화. Hemangioblasts는 그림 1에서 관찰된 세포의 whorls을 쌓여 나타납니다. 공동 문화의 나머지 내용은 보이지 ES – 파생 자손은 조혈 세포의 클러스터 (그림 1)과 같이 나타납니다. Day6 / 7 2-4 셀 클러스터가 나타납니다 및 공동 문화의 날 9분의 8로 큰 세포 클러스터 (자기편과 정지에 모두)로 성장합니다. 기타 ES 파생 자손도 단단히 자기편 stromal 세포 계층 내에서 바운드 볼 수 있습니다.
프로토콜에 표시되지 않지만, 그것은 FBS가 ES 성장 매체, mStrawberry OP9 성장 매체와 ES / mStrawberry OP9 차별화 미디어에서 사용되는 미리 테스트하는 것이 중요합니다. 제대로 혈청 분화의 5 일 전까지 공동 문화에 적절한 mStrawberry OP9 세포의 성장뿐만 아니라, ES 세포의 적절한 분화를 보장해야 테스트. 대안 또는 mStrawberry OP9 세포 이외에, OP9 전지 전에 (7.8×10 4 셀 / cm 2) confluency에서 시딩하기 위해 8000 래드에서 조사 수 있습니다. OP9 세포의 조사는 하류 assays에서 OP9 세포를 오염, 이전의 거의 완전한 제거를 허용뿐만 아니라, 반복 replating 단계의 제거를 허용합니다.
OP9 세포가 CMV 프로 모터의 제어 (pRRLsin – CMV 벡터, UCLA 벡터 코어) 아래 lentiviral 벡터 표현 mStrawberry의 3ug/mL와 OP9 세포 transducing하여 mStrawberry 단백질을 표현할 수 있도록 설계되었습니다.
표준 ES/OP9 공동 문화 프로토콜은 세포 통로에서 OP9 세포를 오염 오래된 줄이기 위해뿐만 아니라, 합류 레이어 OP9 세포에 5 일 replating 단계를 ES 세포의 위치를 수반. 또한, 정지에서 발견 유일한 조혈 세포 ES – 파생 자손의 평가를 위해 제거됩니다. 그러나, replating 단계만을 정지 세포의 수확 모두 하나가 잠재적인 개발의 상당수 ES – 파생 조혈 세포를 그리워. 이 문제는 녹아웃 에스 라인과 관련된 조혈 결함을 특성화하려고 할 때 주소로 중요 해지고 있습니다. 이 문제를 우회하기 위해 우리 실험실 OP9 세포를 mStrawberry – 표현의 사용을 통해, 수정 공동 문화를 사용합니다. 이것은 모든 ES의 자손은 매일 5 시에 공동 문화의 지속으로 전송됩니다 것을 보장하고, 하류 assays 모든 ES – 파생 자손의 수확. 이 수정은 인간 및 마우스의 ES 라인 모두에서 파생된 조혈 자손의 평가와 특성화에 유용한 도구를 제공합니다.
다양한 단계와 최종 원시 조혈이 ES – mStrawberry OP9 공동 문화 모델 recapitulates. 조혈 개발의 초기 단계를 공부에 많은 사람들이 ES 세포에서 hemangioblast의 발전을 평가 BL – CFC (콜로니 형성 세포 블래스트와 같은) 분석을 사용합니다. 초기 조혈 개발을 조사 때 BL – CFC 분석이 유용한 도구이지만 그것이 hemangioblast의 평가뿐만 아니라, 더 많은 성인 조혈 lineages을 허용으로 mStrawberry – ES 공동 문화 시스템은 증가 유틸리티를 전시하고있다.
전통 OP9/ES 및 EB 차별 프로토콜을 사용하여 이전 작업 순서 등 HoxB4의 overexpression로, 아마도 필요한 추가 요소가 체외에서 조혈 줄기 세포를 repopulating 장기 파생 것으로 나타났습니다. 추가 작업은 mStrawberry 부정, 정렬 ES – 파생 인구 사실 조혈 줄기 세포를 포함 여부를 평가하는 것이 필요합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 설치 및 mStrawberry OP9 세포 라인의 테스트 U. Ganapati 감사합니다. 또한, 우리는 공동 문화와 H. Shafifor 한테 도움을 주셔서 감사합니다. HP는 국립 심장, 폐, 및 혈액 연구소 (F31HL087714) (HP)의 화목에 의해 지원됩니다. 이 작품의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 심장, 폐, 그리고 혈액 연구소 또는 국립 보건원 (NIH)의 공식 견해를 대변하지 않습니다. UCLA의 유동세포계측법 핵심 시설은 NIH (CA – 16042 및 AI – 28697), 존슨 암 센터, UCLA 에이즈 연구소와 의학의 UCLA 학교에서 지원됩니다.
OP-9 Cell Maintenance Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Omega Scientific | FB01 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-C I | 200nM |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |
ES/OP-9 Cell Differentiation Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Hyclone | SH30070 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200mM |
PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-031-CV | |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |