O uso de sistemas NanoDrop microvolume como alternativas práticas e eficientes para a metodologia de quantificação de ácidos nucleicos tradicional é descrito através da demonstração de dois protocolos microvolume quantificação de ácidos nucleicos.
Ensaios de biomolecular estão continuamente a ser desenvolvido, que utiliza quantidades progressivamente menores de material, muitas vezes impossibilitando o uso de cubeta convencional baseada em instrumentos para quantificação de ácidos nucleicos para aqueles que podem realizar quantificação microvolume.
O NanoDrop microvolume sistema de retenção de amostra (Produtos NanoDrop Thermo Scientific) funções através da combinação de tecnologia de fibra óptica e propriedades tensão natural da superfície para captar e reter pequenas quantidades de amostra independente de aparelhos de contenção tradicionais, como tinas ou capilares. Além disso, o sistema utiliza comprimentos de caminho mais curto, que resultam em uma ampla gama de medições da concentração do ácido nucléico, essencialmente, eliminando a necessidade de realizar diluições. Reduzindo o volume de amostra necessário para análise espectroscópica também facilita a inclusão de etapas adicionais de controle de qualidade em todo muitos fluxos de trabalho molecular, aumentando a eficiência e, finalmente, levando a uma maior confiança nos resultados a jusante.
A necessidade de análise de alta sensibilidade fluorescentes de massa limitada também surgiu com os recentes avanços experimentais. Usando a mesma tecnologia de retenção de amostra microvolume, medições fluorescentes pode ser realizada com 2 mL de material, permitindo fluorescentes requisitos ensaios volume a ser reduzido significativamente. Microreactions tais de 10 mL ou menos são agora possíveis através de um fluorospectrometer microvolume dedicados.
Dois protocolos microvolume quantificação de ácidos nucleicos será demonstrado que o uso de sistemas integrados de retenção de amostra como alternativas práticas para cuvete tradicionais baseados em protocolos. Primeiro, um método de absorção direta A260 usando um espectrofotômetro microvolume é descrito. Isto é seguido por uma demonstração de um método baseado em fluorescência que permite redução de volume reações de fluorescência com uma fluorospectrometer microvolume. Estas novas técnicas permitem a avaliação das concentrações de ácido nucléico que variam de 1 pg / mL a 15.000 ng / mL com o consumo mínimo de amostra.
Os protocolos de quantificação aqui apresentados são baseados no mais aceita microvolume sistemas. Tais sistemas fornecem alternativas práticas para a metodologia de quantificação de ácidos nucleicos tradicionais, que contam com maiores volumes de amostra e do uso de aparelhos de contenção.
NanoDrop microvolume tecnologia emprega um sistema de retenção de amostra que se baseia nas propriedades de tensão de superfície da amostra que está sendo medido para formar uma coluna de líquido. É essencial que a amostra entra em contato com a superfície superior e inferior de medição óptica para a formação de coluna adequada. Se em algum momento os resultados da medição não parece ser preciso ou não reprodutíveis, o mais provável é o resultado da heterogeneidade da amostra ou quebra de coluna líquida.
Detergentes e álcool isopropílico não são recomendados agentes de limpeza, pois podem descondicionar as superfícies de medição pedestal. Um pedestal incondicionada ocorre quando as propriedades de superfície hidrofóbica do pedestal ter sido comprometida, resultando em um achatamento da gota de amostra. Pedestais incondicionado pode levar à quebra da coluna de líquido durante a medição.
Figura 3. Incondicionado superfície é caracterizada por um achatamento de uma gota de água.
Superfícies pedestal Uncondtioned podem ser recondicionados usando compostos Pedestal NanoDrop Recondicionamento (PR-1, os produtos Thermo Scientific NanoDrop). Uma fina camada de composto de recondicionamento é aplicada às superfícies pedestal superior e inferior, deixa-se secar para ~ 30 segundos, em seguida, esfregou fora de usar um pano limpo, sem fiapos, limpe a seco laboratório. Um estado com sucesso recondicionados é caracterizada por uma gota de água beading acima quando aplicados à superfície pedestal inferior.
Figura 4. Recondicionados Uma superfície é caracterizada por uma beading de uma gota de água.
Sistemas de quantificação Microvolume reduzir significativamente o consumo de amostra e aumentar drasticamente a faixa de concentração, quando comparado aos sistemas de quantificação mais tradicionais. Embora a quantificação microvolume tem freqüentemente se tornado uma tecnologia que permite em circunstâncias envolvendo massa celular limitados, tais como biópsias de agulhas e laser de captura de microdissecção, a eficiência ea facilidade de utilização desta metodologia tornou um alternativas amplamente aceitas para os métodos tradicionais de quantificação de ácidos nucleicos mesmo quando a amostra é abundante.
The authors have nothing to disclose.
Richard W. Beringer e David L. Ash, Aplicações Os cientistas, os produtos NanoDrop Thermo Scientific, de assistência técnica e filmagens.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | ||
NanoDrop 3300 | Thermo Fisher Scientific | ND-3300 |