مولد الرمع الفحص : خلايا منتسب
Summary
وقد أنشئت انطباق مقايسة لتقييم جدوى مولد الرمع الإنجابية لأكثر من 50 عاما. نحن هنا لشرح اجراءات عامة لأداء مولد الرمع مقايسة مع خلايا ملتصقة.
Abstract
تم تأسيس (أو تشكيل مستعمرة) مولد الرمع مقايسة لأكثر من 50 عاما ، وقد نشرت الورقة الأصلية التي تصف هذه التقنية في عام 1956 1. وبصرف النظر عن توثيق الأسلوب ، ولدت في دراسة المعالم الأولية أول منحنى الاستجابة للجرعة الاشعاع بالأشعة السينية المشع خلايا (هيلا) الثدييات في الثقافة 1. في الأساس ، وفحص مولد الرمع تمكن من إجراء تقييم للاختلافات في البقاء الإنجابية (قدرة الخلايا على إنتاج ذرية ، أي خلية واحدة لتشكيل مستعمرة من 50 أو أكثر من الخلايا) بين الخلايا والخلايا غير المعالجة السيطرة التي خضعت العلاجات المختلفة مثل التعرض والإشعاع المؤين ، والمركبات الكيميائية المختلفة (وكلاء السامة للخلايا ، مثلا) أو في الحالات الأخرى التلاعب الجيني. أصبح مقايسة التقنية الأكثر قبولا في البيولوجيا الإشعاعية واستخدمت على نطاق واسع لتقييم مدى حساسية الإشعاع من خطوط مختلفة من الخلايا. كذلك ، يستخدم عادة لفحص مولد الرمع لرصد فعالية مركبات تعديل والإشعاع لتحديد تأثيرات العوامل السامة للخلايا وغيرها من العلاجات المضادة للسرطان على قدرة تشكيل مستعمرة ، في خطوط مختلفة من الخلايا. وبقاء مولد الرمع نموذجية التجربة باستخدام الخلايا الملتصقة خطوط ينطوي على ثلاثة عناصر متميزة ، 1) معالجة المونولاير خلية في قوارير زراعة الأنسجة ، 2) إعداد تعليق خلية واحدة والطلاء عدد مناسب من الخلايا في أطباق بتري و 3) تحديد وتلطيخ المستعمرات بعد فترة حضانة ذات الصلة ، والتي يمكن أن تتراوح بين 1-3 أسابيع ، اعتمادا على خط الخلية. نحن هنا لشرح اجراءات عامة لأداء مولد الرمع مقايسة مع خطوط الخلايا الملتصقة مع استخدام لخلد الإنسان خط خلية خلية كيراتينية (FEP – 1811) 2. أيضا ، ويهدف لدينا هي لوصف الخصائص المشتركة للالمقايسات مولد الرمع بما في ذلك حساب الكفاءة والطلاء والكسور البقاء بعد التعرض للإشعاع من الخلايا ، ومثالا على التعديل استجابة للإشعاع مع استخدام صيغة الطبيعية المضادة للأكسدة.
Protocol
Discussion
في هذا المثال تم علاج الإنسان FEP – 1811 الكيراتينية بتركيزات مختلفة تصل الى 100 ميكروغرام / مل CPF ؛ تظهر البيانات لمدة 20 ميكروغرام / مل CPF لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. وكانت الخلايا المشع بعد العلاج مع 4 غراي باستخدام مصدر سيزيوم 137 (1000 Gammacell irradiator النخبة ؛ Nordion الدولية ، O…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ومن المسلم به بدعم من المعهد الأسترالي للعلوم والهندسة النووية. وكان TCK المستلم من الجوائز AINSE. يتم اعتماد مختبر الطب التي Epigenomic الوطني للصحة ومجلس البحوث الطبية في استراليا (566559). HR معتمد من قبل الاسترالي بعد التخرج والجوائز BakerIDI شرارة مشرق. ويتم تمويل هذا العمل من قبل لجنة حقوق الطفل للتنمية الطبية المحدودة التصوير (CRC – BID) ، التي أنشئت بموجب ودعمت الحكومة الأسترالية مراكز البحوث التعاونية البرنامج. ثاني أكسيد الكربون هو المستفيد استرالي بعد التخرج الجائزة وعلى منحة تكميلية CRC – BID.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI-Chem | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
Referências
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
