克隆形成含量：贴壁细胞
Summary
克隆形成生殖可行性的评估检测的适用性已成立超过50年。在这里，我们展示了贴壁细胞进行克隆形成实验的一般程序。
Abstract
克隆形成（或菌落形成）检测已建立了超过50年;，原文件，描述该技术是在1956年1出版。除了 记录方法，初步具有里程碑意义的研究产生的X射线照射哺乳动物细胞（HeLa细胞）培养1的辐射剂量反应曲线。从根本上讲，克隆形成实验，使生殖可行性的差异（细胞产生的后代的能力，即一个单细胞，形成了50个或更多细胞的殖民地）的评估，经历了各种治疗方法，如曝光控制未经处理的细胞和细胞之间的电离辐射，各种化学化合物（如细胞毒性药物）或在其他情况下的遗传操纵。该试剂盒已成为辐射生物学中最广泛接受的技术，并已被广泛用于评估不同的细胞系的放射敏感性。此外，克隆形成实验是常用的监测辐射修改化合物的疗效，并为确定集落形成能力，在不同的细胞系，细胞毒性药物和其他抗癌疗法的影响。一个典型的形成群落的生存实验，使用贴壁细胞线涉及到三个不同的组件，1）单层细胞在组织培养瓶中治疗，2）制备单细胞悬液，电镀适当数量的细胞在培养皿中和3），固定和染色菌落相关的潜伏期之后，范围从1-3周，这取决于细胞系。在这里，我们展示了执行与使用同一个永生化人角质形成细胞线（FEP – 1811）2贴壁细胞系的克隆形成实验的一般程序。此外，我们的目的是描述克隆形成实验的共同特征，包括细胞对辐射的暴露后的电镀效率和生存分数的计算，并体现与使用的一种天然抗氧化剂配方辐射响应的修改。
Protocol
Discussion
在这个例子中，人类的FEP – 1811角质形成细胞处理不同浓度高达100微克/毫升的中央公积金;数据显示为20微克/毫升中央公积金为1小时37 ° C。治疗后细胞使用的137 Cs源（1000 Gammacell精英辐照; Nordion公司国际上，加拿大1.6 GY /分钟）与4 Gy的照射。对于控制未经处理和药物治疗只有100个细胞接种在每个培养皿中，细胞每盘1000辐照样品镀。正如上述表格中所指出的，使用立体显微镜或数码图像（图…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
澳大利亚核科学与工程学院的支持，是公认的事实。 TCK的是AINSE奖项的收件人。表观医学实验室是支持由国家卫生和澳大利亚的医学研究理事会（566559）。人力资源是由澳大利亚的研究生和BakerIDI明亮的火花奖。生物医学成像发展有限公司（CRC投标），建立和澳大利亚政府的合作研究中心计划下支持，这项工作是由“儿童权利公约”。 CO是收件人澳大利亚研究生奖和一个CRC投标补充奖学金。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI-Chem | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
Referências
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
