Monogene Assay: hechtende cellen
Summary
De toepasselijkheid van de Monogene assay voor het evalueren van reproductieve levensvatbaarheid is vastgesteld voor meer dan 50 jaar. Hier laten we zien de algemene procedure voor het uitvoeren van de Monogene assay met hechtende cellen.
Abstract
De Monogene (of kolonievormende) test is vastgesteld voor meer dan 50 jaar; de originele papieren beschrijving van de techniek werd gepubliceerd in 1956 1. Naast het documenteren van de methode, de eerste belangrijke studie opgewekte de eerste bestraling-dosis-respons curve voor X-ray bestraald zoogdieren (HeLa) cellen in cultuur 1. Kortom, de Monogene assay maakt een evaluatie van de verschillen in de reproductieve levensvatbaarheid (capaciteit van cellen om nageslacht te produceren, dwz een enkele cel tot een kolonie van 50 of meer cellen vorm) tussen controle onbehandelde cellen en cellen die hebben ondergaan verschillende behandelingen, zoals blootstelling aan aan ioniserende straling, diverse chemische verbindingen (bv. cytotoxische stoffen), of in andere gevallen genetische manipulatie. De test is uitgegroeid tot de meest geaccepteerde techniek in straling biologie en is op grote schaal gebruikt voor het evalueren van de straling gevoeligheid van verschillende cellijnen. Verder is de Monogene assay gebruikt voor het toezicht op de werkzaamheid van straling wijzigen verbindingen en voor het bepalen van de effecten van cytotoxische middelen en andere anti-kanker medicijnen op kolonievormende vermogen, in verschillende cellijnen. Een typische Monogene survival experiment met behulp van hechtende cellen lijnen bestaat uit drie afzonderlijke componenten, 1) de behandeling van de cel monolayer in weefselkweek flessen, 2) de voorbereiding van enkele cel suspensies en plating een passend aantal cellen in petrischalen en 3) de vaststelling en vlekken kolonies na een relevante incubatieperiode, kunnen die variëren van 1-3 weken, afhankelijk van de cellijn. Hier laten we zien de algemene procedure voor het uitvoeren van de Monogene test met aanhanger cellijnen met het gebruik van een onsterfelijke, menselijke keratinocyte cellijn (FEP-1811) 2. Ook onze doelstellingen zijn om de gemeenschappelijke kenmerken van Monogene proeven, waaronder de berekening van de beplating efficiency en de overleving fracties na blootstelling van cellen aan straling te beschrijven en modificatie van straling-response voorbeelden met het gebruik van een natuurlijke antioxidant formulering.
Protocol
Discussion
In dit voorbeeld is de menselijke FEP-1811 keratinocyten werden behandeld met verschillende concentraties tot 100 ug / ml CPF; gegevens worden getoond voor de 20 ug / ml CPF gedurende 1 uur bij 37 ° C. Na de behandeling cellen werden bestraald met 4 Gy met behulp van een 137 Cs bron (Gammacell 1000 Elite bestraler, Nordion International, ON, Canada; 1,6 Gy / min). Voor de controle onbehandelde en drugs alleen behandelingen 100 cellen werden uitgeplaat in elke petrischaal en 1000 cellen per schaal werden uitg…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De steun van het Australian Institute of Nuclear Science and Engineering wordt erkend. TCK was de ontvanger van AINSE awards. Epigenomisch Medicine Lab wordt ondersteund door de National Health en Medical Research Council van Australië (566.559). HR wordt ondersteund door een Australische post-graduate en BakerIDI Bright Spark awards. Dit werk wordt gefinancierd door het CRC for Biomedical Imaging Development Ltd (CRC-BID), opgericht en ondersteund door Cooperative de Australische regering Research Centres programma. CO is de ontvanger een Australische post-graduate award en een CRC-BID aanvullende beurs.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI-Chem | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
Referências
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
