Assay Clonogenic: תאים חסיד
Summary
תחולתה של assay clonogenic להערכת הכדאיות הרבייה הוקם עבור יותר מ -50 שנה. כאן אנו מדגימים את הנוהל הכללי לביצוע assay clonogenic עם תאים חסיד.
Abstract
Assay (או מושבה להרכיב) clonogenic הוקם במשך יותר מ 50 שנים; את הנייר המקורי המתאר את השיטה פורסמה בשנת 1956 1. מלבד המתעדים את השיטה, את המחקר ציון דרך הראשוני שנוצר כבר בסיבוב הראשון קרינה במינון התגובה רנטגן מוקרן (הלה) בתאי יונקים בתרבות 1. ביסודו של דבר, assay clonogenic מאפשר הערכה של ההבדלים הכדאיות הרבייה (יכולת של התאים לייצר צאצאים, כלומר תא בודד להקים מושבה של 50 תאים או יותר) בין לתאי קבוצת הביקורת תאים שעברו טיפולים שונים כגון חשיפה כדי מייננת קרינה, תרכובות כימיות שונות (סוכני ציטוטוקסיות למשל) או במקרים אחרים מניפולציה גנטית. Assay הפך את הטכניקה המקובלת בביולוגיה קרינה כבר בשימוש נרחב להערכת רגישות לקרינה של שורות תאים שונות. יתר על כן, assay clonogenic נפוץ לניטור יעילות של תרכובות קרינה שינוי ו לקביעת ההשפעות של סוכני ציטוטוקסיות אחרות נגד סרטן ותרופות על היכולת להרכיב המושבה, שורות תאים שונות. ניסוי טיפוסי הישרדות clonogenic חסיד באמצעות קווי תאים כוללת שלושה מרכיבים נפרדים, 1) טיפול monolayer התא צלוחיות בתרבית רקמה, 2) הכנת תרחיפים תא יחיד ציפוי המספר המתאים של תאים בצלחות פטרי ו -3) תיקון ו מכתים המושבות לאחר תקופת דגירה רלוונטי, אשר יכול לנוע בין 1-3 שבועות, בהתאם לקו הסלולרי. כאן אנו מדגימים את הנוהל הכללי לביצוע assay clonogenic עם שורות תאים חסיד עם השימוש של קו תאים אנושיים הנציח keratinocyte (FEP-1811) 2. כמו כן, המטרות שלנו הן כדי לתאר תכונות משותפות של מבחני clonogenic כולל חישוב יעילות ציפוי שברים ההישרדות לאחר חשיפה לקרינה של תאים, וכדי להדגים שינוי בתגובה קרינה עם השימוש ניסוח נוגדי חמצון טבעיים.
Protocol
Discussion
בדוגמה זו האדם FEP-1811 קרטינוציטים טופלו בריכוזים שונים של עד 100 מיקרוגרם / מ"ל ע.מ., הנתונים הראו על 20 מיקרוגרם / מ"ל ע.מ. שעה 1 ב 37 ° C. תאים בעקבות הטיפול היו מוקרן עם 4 Gy באמצעות מקור 137 Cs (Gammacell 1000 irradiator עלית; Nordion הבינלאומי, על, קנדה; 1.6 Gy / min). בשביל לשלוט על טי?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
התמיכה של המכון האוסטרלי גרעיני מדע והנדסה הוא הודה. TCK היה זכה בפרסים AINSE. המעבדה לרפואה epigenomic נתמכת הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (566,559). HR נתמך על ידי אוסטרלי לתארים ופרסים BakerIDI ניצוץ בהיר. עבודה זו ממומנת על ידי ה-CRC עבור ביו הדמיה ופיתוח בע"מ (CRC-BID), שהוקם ונתמך תחת שיתופית התוכנית של ממשלת אוסטרליה מחקר מרכזי. CO הוא חתן פרס האוסטרלי לתארים מתקדמים וכן מלגה CRC-BID משלים.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI-Chem | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
Referências
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
