Клоногенных Пробирной: прилипшие клетки
Summary
Применимость анализа клоногенных для оценки репродуктивной жизнеспособности была создана более 50 лет. Здесь мы показываем, общий порядок выполнения анализа клоногенных с прилипшие клетки.
Abstract
Клоногенных (или колониеобразующих) анализа была создана более 50 лет; оригинальная статья, описывающая метод был опубликован в 1956 году 1. Помимо документального метода, первоначальное исследование ориентиром создается при первом радиационно-дозовой кривой для рентгеновских облученных млекопитающих (HeLa) клеток в культуре 1. В принципе, анализ клоногенных позволяет оценить различия в репродуктивных жизнеспособность (способность клеток к воспроизведению потомства, то есть одну ячейку, чтобы сформировать колонию 50 и более клеток) между контролем необработанных клетках и клетках, которые подверглись различные методы лечения, такие как воздействие ионизирующего излучения, различные химические соединения (например, цитостатики), либо в других случаях генетических манипуляций. Анализа стал наиболее широко принятый метод в области радиационной биологии и широко используется для оценки радиационной чувствительности различных клеточных линий. Кроме того, анализ клоногенных обычно используется для мониторинга эффективности излучения изменения соединений и для определения эффектов цитотоксических агентов и других противораковых терапии на колониеобразующих способности, в различных клеточных линий. Типичный выживания клоногенных эксперимент с использованием сторонником линии клетки включает в себя три отдельных компонента, 1) лечение клеточный монослой в колбах культуре тканей, 2) подготовка одного суспензии клеток и покрытие соответствующее число клеток в чашках Петри и 3) установление и окрашивание колонии Следующие соответствующего периода инкубации, которые могут варьироваться от 1-3 недель, в зависимости от клеточной линии. Здесь мы показываем, общий порядок выполнения анализа клоногенных с приверженцем клеточные линии с использованием увековечены кератиноцитов человека клеточной линии (FEP-1811) 2. Кроме того, наши цели, чтобы описать общие черты анализов клоногенных в том числе расчет эффективности покрытий и выживания фракций после контакта клеток к радиации, и примером модификации радиационно-ответ с использованием природных формулировка антиоксидант.
Protocol
Discussion
В этом примере человека FEP-1811 кератиноцитов лечили различные концентрации до 100 мкг / мл СПЛ; данные будут показаны на 20 мкг / мл СПЛ в течение 1 часа при температуре 37 ° C. После лечения клетки облучали 4 Гр использованием 137 Cs источника (Gammacell 1000 Elite облучателя; Nordion International, ON, Канада, 1,6 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддержке австралийского Института ядерной науки и техники не будет подтверждено. TCK был удостоен AINSE наград. Эпигеномном Лаборатории медицины при поддержке национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (566 559). HR поддерживается австралийской аспирантуре и BakerIDI ярких наград искры. Эта работа финансируется за счет CRC для биомедицинской визуализации Development Ltd (CRC-BID), созданы и поддерживаются в совместную программу исследований австралийского правительства центров. СО является получателем австралийской аспирантов награду и CRC-BID дополнительные стипендии.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI-Chem | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
Referências
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
