Klonogena analysen: Vidhäftande Cells
Summary
Tillämpligheten av klonogena test för utvärdering av reproduktiv lönsamheten har varit etablerad i mer än 50 år. Här kan vi visa det allmänna förfarandet för att utföra klonogena analys med tillhörande celler.
Abstract
Den klonogena (eller kolonibildande assay) har varit etablerad i mer än 50 år, de ursprungliga papper som beskriver tekniken publicerades 1956 1. Förutom att dokumentera metoden genererade första banbrytande studie den första strålning dosresponskurvan för röntgen bestrålade däggdjur (HeLa) celler i kultur 1. I grund och botten gör det möjligt klonogena analysen en bedömning av skillnader i reproduktiv livskraft (förmåga celler att producera avkomma, det vill säga en enda cell att bilda en koloni med 50 eller flera celler) mellan kontroll obehandlade celler och som har genomgått olika behandlingar såsom exponering för joniserande strålning, olika kemiska föreningar (t ex cytostatika) eller i andra fall genmanipulation. Analysen har blivit den mest accepterade teknik i strålningsbiologi och har i stor utsträckning använts för att utvärdera strålningen känslighet för olika cellinjer. Vidare är klonogena analys som ofta används för att övervaka effekten av strålningen ändra föreningar och för att bedöma effekterna av cytostatika och andra anti-cancer läkemedel på kolonibildande förmåga, i olika cellinjer. En typisk klonogena överlevnad experiment med tillhörande cellinjer innefattar tre olika delar, 1) behandling av cellen cellslager i behållare vävnadsodling, 2) beredning av enskilda cellsuspensioner och plätering ett lämpligt antal celler i petriskålar och 3) fastställande och färgning kolonier efter en relevant inkubationstid, som kan variera från 1-3 veckor, beroende på vilken cellinje. Här kan vi visa det allmänna förfarandet för att utföra klonogena analysen med tillhörande cellinjer med hjälp av ett förevigat mänskliga keratinocyte cellinje (FEP-1811) 2. Även vårt mål är att beskriva vanliga funktioner i klonogena analyser, bland annat beräkning av bordläggningen effektivitet och fraktioner överlevnad efter exponering av celler för strålning och att exemplifiera modifiering av strålning-respons med hjälp av en naturlig antioxidant formulering.
Protocol
Discussion
I detta exempel mänskliga FEP-1811 keratinocyter behandlades med olika koncentrationer upp till 100 mikrogram / ml CPF, data visas för 20 mikrogram / ml CPF i 1 timme vid 37 ° C. Efter behandling celler bestrålas med 4 Gy med hjälp av en 137 Cs källa (Gammacell 1000 Elit irradiator, Nordion International, ON, Kanada, 1,6 Gy / min). För kontroll obehandlade och drog bara behandlingar 100 celler var klädd i varje petriskål och 1000 celler per fat var klädd för bestrålade prover. Som framgår av tabe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stödet från Australian Institute of Nuclear Science and Engineering är erkänd. TCK var mottagare av AINSE utmärkelser. Epigenomiska Medicin Lab stöds av det nationella hälso-och medicinska forskningsrådet i Australien (566.559). HR stöds av en australisk forskar-och BakerIDI ljusa utmärkelser gnista. Detta arbete finansieras av CRC för biomedicinsk avbildning Development Ltd (CRC-bud), etablerade och stöd inom ramen för den australiensiska regeringens Kooperativa Research Centres-programmet. CO är mottagaren en australisk forskarutbildning tilldelning och en CRC-bud kompletterande stipendium.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI-Chem | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
Referências
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
