חלקיק יחיד מיקרוסקופית אלקטרונים שיקום במתחם Exosome שימוש בשיטה אקראיים הטיה חרוטי
Summary
מאמר זה מתאר שיטה סטנדרטית לקבל תלת ממדי (3D) שחזור של מקרומולקולות ביולוגיות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מכתים שלילי (EM). בפרוטוקול זה, אנו מסבירים כיצד לקבל את מבנה 3D של מורכבות exosome cerevisiae Saccharomyces ברזולוציה בינונית באמצעות שחזור אקראי חרוטי להטות את השיטה (RCT).
Abstract
חלקיק יחיד מיקרוסקופית אלקטרונים (EM) שחזור לאחרונה הפך לכלי פופולרי כדי לקבל את תלת ממדי (3D) מבנה של קומפלקסים macromolecular גדול. לעומת קריסטלוגרפיה רנטגן, יש לו כמה יתרונות ייחודיים. ראשית, אחד החלקיקים EM שחזור לא צריך לגבש את המדגם חלבון, המהווה את צוואר הבקבוק קריסטלוגרפיה רנטגן, במיוחד עבור מתחמי macromolecular גדול. שנית, זה לא צריך כמויות גדולות של דגימות חלבון. לעומת מיליגרם של החלבונים הדרושים התגבשות, יחיד שחזור EM החלקיקים רק צריך כמה מיקרו ליטר פתרון חלבון ננו טוחנת ריכוזים, באמצעות צביעה בשיטה שלילי EM. עם זאת, למרות כמה אסיפות macromolecular עם סימטריה גבוהה, חלקיק יחיד EM מוגבל ברזולוציה נמוכה יחסית (ברזולוציה נמוכה יותר מאשר 1 ננומטר) עבור דגימות רבים במיוחד אלה ללא סימטריה. טכניקה זו היא מוגבלת גם על ידי גודל של מולקולות הנחקרת, כלומר 100 kDa עבור דגימות מוכתם שלילי 300 kDa עבור קפוא hydrated דגימות בכלל.
עבור מדגם חדש של מבנה ידוע, אנחנו בדרך כלל להשתמש בפתרון מתכות כבדות להטביע את המולקולות על ידי מכתים שלילי. הדגימה נבדקת אז מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים לקחת דו ממדי (2D) micrographs של המולקולות. באופן אידיאלי, מולקולות חלבון יש מבנה 3D הומוגנית אבל התערוכה אוריינטציות שונות micrographs. Micrographs אלה דיגיטציה ומעובד מחשבים כמו "חלקיקי בודד". שימוש דו מימדי יישור וטכניקות סיווג, מולקולות הומוגנית בתצוגות אותו מקובצים לתוך הכיתות. הממוצעים שלהם לשפר את האות של צורות 2D של המולקולה. אחרי שאנחנו להקצות את חלקיקי עם אוריינטציה היחסי הנכון (זוויות אוילר), נוכל לשחזר את תמונות החלקיקים 2D לתוך נפח 3D הווירטואלי.
בשחזור חלקיק בודד 3D, צעד חיוני היא נכונה להקצות את הכיוון הנכון של כל חלקיק יחיד. ישנן מספר שיטות כדי להקצות את התצוגה עבור כל חלקיק, כולל בריאורגניזציה זוויתי 1 ו אקראי להטות חרוטי (RCT) שיטה 2. בפרוטוקול זה, אנו מתארים תרגול שלנו מקבל את שחזור 3D מורכבים תוך שימוש בשמרים exosome מכתים EM שלילי RCT. יצוין כי הפרוטוקול שלנו במיקרוסקופ אלקטרונים ועיבוד תמונה כדלקמן את העיקרון הבסיסי של RCT אבל היא לא הדרך היחידה לבצע את השיטה. אנחנו הראשונים מתארים כיצד להטביע את דגימת החלבון לתוך שכבת Formate-Uranyl עם עובי דומה לגודל חלבון, באמצעות רשת פחמן המחוררת מכוסה בשכבה של הסרט רצוף פחמן דקה. לאחר מכן הדגימה מוכנס לתוך מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים לאסוף untilted (0 מעלות) ו מוטה (55 מעלות) זוגות micrographs שישמש מאוחר יותר לצורך עיבוד וקבלת מודל 3D הראשונית של exosome את השמרים. לשם כך, אנו מבצעים RCT ולאחר מכן לחדד את מודל 3D הראשוני באמצעות הקרנת התאמת שיטת חידוד 3.
Protocol
Discussion
במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט של הכנת המדגם ושלושה שחזור ממדי של המתחם exosome באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שלילי מכתים. באמצעות שיטה זו, השגנו את השחזור באמצעות 3D להטות אקראי שיטה חרוטי ללא כל ידע מוקדם של המבנה. הטיה אקראית שיטה חרוטי לא בהכרח דורשת מדגם הומוגני אך…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לחברי Nogales במעבדה באוניברסיטת קליפורניה בברקלי לסייע להקים את הפרוטוקולים ראשוני חברי וואנג במעבדה באוניברסיטת ייל ב עזרתם להקים את הפרוטוקולים מלא. אנחנו גם מכירים צוותי במתקן cryo-EM ואת בעל ביצועים גבוהים מרכז החישובים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ייל על תמיכתם. HW היא משפחת סמית awardee.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyvinyl Formal Resin | Electron Microscopy Science | 63450-15-7 | ||
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Science | 22451 | ||
| Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientist | 4951F-001 | ||
| 400 mesh grid regular | SPI Supplies | 3040C | ||
| Carbon coater Auto 306 | Edwards | |||
| Tecnai-12 Electron Microscope | FEI | |||
| Glow Discharger | BAL-TEC | Sputter Coater SCD 005 |
Referências
- van Heel, M. Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction. Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).
- Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series. J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).
- Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles. Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative staining and image classification – powerful tools in modern electron microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
- Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
- Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).
- Heel, M. v. a. n., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. UCSF Chimera–a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).
- Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3′ end processing. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).
- Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp. Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).
- Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation. J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).
