ランダムコニカルチルト方式を使用したエキソソーム複合体の単粒子の電子顕微鏡再構成
Summary
この記事では、ネガティブ染色電子顕微鏡（EM）を用いて生体高分子の三次元（3D）再構成を得るために標準的な方法を説明します。このプロトコルでは、我々はランダムな円錐形の傾斜の再構成法（RCT）を使用して中解像度でサッカロマイセスセレビシエエキソソーム複合体の立体構造を取得する方法について説明します。
Abstract
単粒子の電子顕微鏡（EM）の復興は、最近大きな高分子複合体の3次元（3D）構造を得るためによく使われる道具となっている。 X線結晶構造解析と比較すると、それはいくつかのユニークな利点があります。最初に、単一粒子EM再建は特に大きな高分子複合体のために、X線結晶構造解析のボトルネックであるタンパク質試料を、結晶化する必要はありません。第二に、タンパク質サンプルを大量に必要としません。結晶化に必要なタンパク質のミリグラムと比較して、単一の粒子EMの再建はネガティブ染色EM法を用いて、ナノモル濃度のタンパク質溶液のいくつかのマイクロリットルを必要とします。しかし、高い対称性を持ついくつかの高分子アセンブリにもかかわらず、単一の粒子は、EMは、特にそれらの対称性のない多くの標本については（1より小さいナノメートルの分解能）、比較的低解像度で制限されています。このテクニックはまた、研究対象の分子の大きさによって制限され、一般的に凍結水和した試料のためのネガティブ染色標本と300 kDaのための、すなわち約100 kDa。
未知構造の新たなサンプルの場合、我々は一般的に否定的染色によって分子を埋め込むために重金属のソリューションを使用してください。試料は、分子の2次元（2D）の顕微鏡写真を取るために透過型電子顕微鏡で検査されます。理想的には、タンパク質分子が均一な3次元構造を持っていますが、顕微鏡写真で、異なる方向を示す。これらの顕微鏡写真は、"単粒子"としてデジタル化し、コンピュータで処理されます。二次元アライメントと分類の技術を使用して、同じビュー内の均一な分子は、クラスにクラスタ化されています。彼らの平均は、分子の2D形状の信号を強化する。我々は適切な相対的な方向（オイラー角）を持つ粒子を割り当てた後、我々は、3D仮想ボリュームに2次元粒子画像を再構成することができるようになります。
単粒子三次元再構築では、本質的なステップは、正しく各単粒子の正しい方向を割り当てることです。角度再構成1とランダムな円錐形のチルト（RCT）方法2を含め、各粒子のビューを割り当てるには、いくつかの方法があります。このプロトコルでは、我々は否定的染色EMとRCTを用いた酵母エキソソーム複合体の三次元再構成を得ることに私たちの実践を説明します。それは電子顕微鏡と画像処理の我々のプロトコルは、RCTの基本原理を次のように、メソッドを実行する唯一の方法でないことに注意してください。まず、連続的な薄いカーボン膜の層で覆われた穴あきカーボングリッドを使用して、タンパク質の大きさに匹敵する厚さを持つウラニルギの層にタンパク質試料を埋め込む方法について説明します。その後、試料を収集するための透過型電子顕微鏡に挿入されますuntilted（0度）と処理すると酵母のエクソソームの初期3Dモデルを得るために後で使用される顕微鏡の傾斜（55度）のペア。この目的のために、我々は、RCTを実行して、洗練された方法3と一致した投影を使用して初期3Dモデルをリファイン。
Protocol
Discussion
この記事では、サンプル調製の詳細なプロトコルと否定的染色の電子顕微鏡を使用してエキソソーム複合体の三次元再構成を提示する。この方法を使用して、我々は構造の任意の予備知識がなくてもランダム円錐形の傾斜法を用いて三次元再構成を得る。ランダムな円錐形の傾斜法では必ずしも均質なサンプルを必要としませんが、以下の投影に一致する精製ステップでは、高分解能を達成?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、完全なプロトコルを確立するために、ヘルプのエール大学の初期のプロトコルと王研究室のメンバーが確立支援にUCバークレーでノガレス研究室のメンバーに感謝したいと思います。我々はまた、低温電子顕微鏡施設のスタッフとその支援のための医学のイェール大学での高性能計算センターを認めます。 HWは、スミスファミリー受賞者です。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyvinyl Formal Resin | Electron Microscopy Science | 63450-15-7 | ||
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Science | 22451 | ||
| Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientist | 4951F-001 | ||
| 400 mesh grid regular | SPI Supplies | 3040C | ||
| Carbon coater Auto 306 | Edwards | |||
| Tecnai-12 Electron Microscope | FEI | |||
| Glow Discharger | BAL-TEC | Sputter Coater SCD 005 |
Referências
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