Enda partikel elektronmikroskopi Rekonstruktion av Exosome Complex Använda Random Konisk Tilt metod
Summary
Denna artikel beskriver en standardiserad metod för att få en tredimensionell (3D) rekonstruktion av biologiska makromolekyler med hjälp av negativ mikroskopi färgning elektron (EM). I detta protokoll förklarar vi hur du får 3D-strukturen för Saccharomyces cerevisiae exosome komplex på medelhög upplösning med hjälp av slumpmässiga koniska metoden lutning rekonstruktion (RCT).
Abstract
Enda partikel elektronmikroskopi (EM) rekonstruktion har nyligen blivit ett populärt verktyg för att få den tredimensionella (3D) strukturen av stora makromolekylära komplex. Jämfört med röntgenkristallografi, har några unika fördelar. Först behöver enskild partikel EM rekonstruktion inte att kristallisera proteinet provet, som är flaskhalsen i röntgenkristallografi, särskilt för stora makromolekylära komplex. För det andra behöver det inte stora mängder protein prover. Jämfört med milligram av proteiner som behövs för kristallisering, behöver enskild partikel EM återuppbyggnaden bara några mikro-liter protein lösning på nanonivå molära koncentrationer, med hjälp av negativ färgning EM metod. Men trots ett par makromolekylära församlingar med hög symmetri, EM enda partikel är begränsat till relativt låg upplösning (mindre än 1 nm upplösning) i många exemplar, särskilt de utan symmetri. Denna teknik också begränsas av storleken på de molekyler som studeras, dvs 100 kDa för negativt färgade exemplar och 300 kDa för frysta hydrerad exemplar i allmänhet.
För ett nytt prov med okänd struktur, använder vi i allmänhet en tungmetall lösning för att bädda in molekyler av negativa färgning. Provet undersöks sedan i ett transmissionselektronmikroskop att ta två-dimensionella (2D) micrographs av molekylerna. Helst av proteinmolekyler har en homogen 3D-struktur men uppvisar olika inriktningar i micrographs. Dessa micrographs är digitaliserade och bearbetas i datorer som "enstaka partiklar". Med hjälp av två-dimensionell uppriktning och tekniker klassificering, är homogena molekyler i samma åsikter klustrade i klasser. Deras genomsnitt öka signalen av molekylen är 2D-former. Efter att vi tilldela partiklarna med rätt relativ orientering (Euler vinklar), kommer vi att kunna rekonstruera 2D-partikel bilder i en 3D virtuell volym.
I enstaka partikel 3D-rekonstruktion, är ett viktigt steg att korrekt tilldela rätt orientering för varje enskild partikel. Det finns flera metoder för att tilldela vyn för varje partikel, inklusive den kantiga beredning 1 och slumpmässiga koniska lutning (RCT) metod 2. I detta protokoll, beskriver vi vår verksamhet med att få 3D-rekonstruktion av jäst exosome komplexa med negativ färgning EM och RCT. Det bör noteras att vår protokollet för elektronmikroskopi och bildbehandling följer den grundläggande principen för RCT, men är inte det enda sättet att utföra metoden. Vi beskriver först hur att bädda in proteinet provet i ett lager av AUC-Formate med en tjocklek jämförbar med protein storlek, med hjälp av en Holey kol galler täckt med ett lager av tunt kol film. Sedan provet sätts in i ett transmissionselektronmikroskop att samla in icke vridna (0-grader) och lutande (55 grader) par micrographs som kommer att användas senare för bearbetning och få en första 3D-modell av jäst exosome. I detta syfte utför vi RCT och sedan förfina de ursprungliga 3D-modellen med hjälp av projektion matchande förfining metod 3.
Protocol
Discussion
I denna artikel presenterar vi ett detaljerat protokoll av provpreparering och tredimensionell rekonstruktion av exosome komplexa med negativ mikroskopi färgning elektron. Med denna metod fick vi 3D-rekonstruktion med slumpmässiga koniska luta metod utan några förkunskaper i strukturen. Slumpmässiga koniska luta metod kräver inte nödvändigtvis ett homogent prov men följande projektion matchande förfining steg skulle behöva en homogen prov för att uppnå hög upplösning.
För neg…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka medlemmarna i Nogales lab på UC-Berkeley i hjälper till att etablera den första protokollen och medlemmar av Wang lab vid Yale University i deras hjälp för att upprätta fullständiga protokoll. Vi erkänner också den personal i Cryo-EM anläggning och högpresterande Beräkning Center vid Yale School of Medicine för deras stöd. HW är en Smith Family bidraget.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyvinyl Formal Resin | Electron Microscopy Science | 63450-15-7 | ||
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Science | 22451 | ||
| Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientist | 4951F-001 | ||
| 400 mesh grid regular | SPI Supplies | 3040C | ||
| Carbon coater Auto 306 | Edwards | |||
| Tecnai-12 Electron Microscope | FEI | |||
| Glow Discharger | BAL-TEC | Sputter Coater SCD 005 |
Referências
- van Heel, M. Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction. Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).
- Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series. J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).
- Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles. Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative staining and image classification – powerful tools in modern electron microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
- Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
- Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).
- Heel, M. v. a. n., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. UCSF Chimera–a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).
- Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3′ end processing. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).
- Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp. Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).
- Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation. J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).
