Мониторинг динамических изменений в митохондриальной уровня кальция во время апоптоза Использование генетически закодированные Кальций датчика

Summary

Этот протокол описывает метод в режиме реального времени измерения потоков митохондриального кальция флуоресцентные изображения. Метод использует циркулярно permutated YFP основе двойного возбуждения логометрических кальция датчика (логометрических pericam-м) выборочно выражается в митохондриях.

Abstract

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis¹. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol². It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology³. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)⁴ or aequorin⁵ targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of ‘ratiometric-pericam’ which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin⁴. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 μM⁴. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

Protocol

1. Pericam-т Трансфекция и клеточной подготовка. Пластина HeLa клетки ночь перед трансфекции на стерильные покровные стекла, помещаемых в стандартной 6-и культуру пластину. Подготовка ДНК / Lipofectamine 2000 комплексов в соответствии с предложением производителя (Invitrogen). Мы используем 4 мкг логометрических-pericam-т вектор экспрессии и 10 мкл Lipofectamine 2000 разводят в 0,5 мл Opti-MEM для каждой скважины. Камеры должны быть ~ 70% сливной до трансфекции. Замените HeLa питательных сред (Дульбеко изменение орлы среды, 10% FBS, пенициллин / стрептомицин) в каждую лунку с 1,5 мл того же средства массовой информации без антибиотиков. Добавить ДНК / Lipofectamine комплексов в каждую лунку для трансфекции. Осторожно перемешать с качалки и инкубировать в течение 4 часов в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° С, 5% СО 2. Замените антибиотикам свободных средств массовой информации с питательной среды с помощью антибиотиков. Разрешить клетки, чтобы выразить логометрических pericam за 1-2 дня до съемки. 2. Установка микроскопа и Image Acquisition Место покровное с клетками HeLa в соответствующие камеры изображения с решением изображений: 107 мм NaCl, 7,2 KCl, 1,2 мм MgCl 2, 1 мМ CaCl 2, 11,5 мм глюкозы, 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 20 мМ HEPES 7.2. Наша лаборатория использует камеру Attofluor клетку от Invitrogen. Горы изображения камеры в перевернутый столик микроскопа. Найти область интересов, содержащие один или несколько клеток, экспрессирующих логометрических pericam использовании 40x (или выше) нефти погружения цели. Мы обнаружили, что логометрических pericam менее устойчив к фотообесцвечивания при 380 нм, и, таким образом мы используем эту длину волны для определения подходящих клеток. Для изображений, полученных на рисунке 1, Nikon Superfluor 40X объектива с числовой апертурой 1,3 был использован. Высшие цели увеличения бы также целесообразным (60-100x). Возбуждение фильтры были использованы технологии Chroma фильтры D380/30x (380 + / – 30 нм) и D495/10 (495 + / – 5 нм), светоделитель был 505DCXR (505nm longpass), а также выбросов фильтр HQ535/50m (535 + / – 25nm). Наш микроскоп используется для получения изображения на рисунке 1, состоит из Nikon TE2000 инвертированный микроскоп оснащен Ропер Научная Coolsnap HQ охлаждением ПЗС-камера, Ludl MAC6000 быстрого фильтра колесо и чейнджер, и приобретение MetaFluor данных и анализа программного обеспечения. Этот протокол может быть адаптирована к любым стандартным широким полем микроскоп с соответствующими фильтрами и программного обеспечения, способного захвата и обработки логометрических изображений. Настройка программного обеспечения для использования двойного возбуждения 495 и 380 нм фильтра. Кальций привязки к логометрических pericam увеличивает абсорбцию при 495 нм, что коэффициент должен быть создан к 495 nm/380 нм. Логометрический pericam имеет бескальциевой пика возбуждения при 415 нм 4. В этом протоколе мы предлагаем использовать 380 нм фильтра только потому, что повсеместно в большинстве лабораторий кальция изображений. Если 410 нм фильтра доступна, то предпочтительнее фильтр 380 нм. Получение изображений последовательно альтернативно захватывающей на 495 и 380 нм. Получение изображений из базовых уровней кальция, по крайней мере 30 секунд до применения агонистов через перфузии аппарата. Марк того времени для каждого агониста. Выдержки раз и приобретение интервалы должны быть оптимизированы, чтобы предотвратить фотообесцвечивания в то же время обеспечивают достаточное временное например resolution.For, для полу-быстрому кальция динамики мониторинг в ответ на стимуляцию агонистами, изображения были приобретены через каждые две секунды на рисунках 1В и С. Гораздо быстрее ставки приобретения Возможны также 6. Долгосрочные изображений после стауроспорин администрации был приобретен с более длительным интервалом (30) между приобретений (рис. 1 D и Е). 3. Обработки и анализа изображений Как только эксперимент завершен, полученные изображения можно анализировать в автономном режиме. Определить регионы интереса (ROI), в которой вы хотите отслеживать изменения в уровни кальция. Используйте ROI выбран в пустую область поля вычесть фон, если это необходимо. Следует отметить, что митохондрии являются весьма подвижны и динамичны, и экстраполировать события в одной митохондрии в течение длительного периода не всегда возможно. Таким образом, учитывая высокую подвижность этой органеллы в некоторых типах клеток, выбор ROI должны быть тщательно проверены. Кроме того, о чем свидетельствует на рисунке 1, митохондрии ответ гетерогенно на различные раздражители. Поэтому очень важно для анализа данных в автономном режиме и контролировать RO1 размещения на кадр за кадром. Подробное описание измерения митохондриального кальция в сильно подвижных митохондрии была описана в другом месте 7. Полученный коэффициент измерений ROI могут быть импортированы в Excel или аналогичные graphingsoftware. Данные могут быть представлены в виде следов представляющего изменений в митохондриальной уровня кальция в одной ячейке или отдельные митохондрии, или усредненные этuorescence сигналы от нескольких ROI. Мы также использовали эту технику для измерения средней митохондриальные уровни кальция в популяции лимфоцитов проходит апоптоз, вызванный Fas лиганд 8. 4. Представитель Результаты: Рисунок 1. (А) субклеточных локализации логометрических-pericam-т. Это первое изображение показывает живой клетки HeLa выражения логометрических-pericam-т. Второе изображение показывает флуоресцентного окрашивания митохондрий-селективного красителя MitoTracker CMXRos Red. Желтой флуоресценции в объединенной изображение демонстрирует совместное локализации логометрических-pericam-т и MitoTracker флуоресценции. (B) серии псевдо-отношение (495:380 нм) изображения 4 клеток HeLa выражения MT-логометрических pericam обрабатывают 10 мМ АТР . (С) Количественная оценка изменений в митохондриальной уровня кальция в области интереса (ROI), указанных в (б) обрабатывают 10 мМ АТФ. (D) серии псевдо-отношение (495:380 нм) изображения ячейки HeLa выражения тонн -логометрических pericam получавших 0,5 мкМ стауроспорин. Неоднородность в ответ кальция в отдельных митохондрий очевидна, а также значительная фрагментация митохондрий на 60 минут. Некоторые митохондрии имеют колебательный увеличение кальция (белая голова стрелка), тогда как другие не показывают значительных изменений в уровень кальция (желтая голова стрелка). (Е) Количественный рост глобальной митохондриальные уровни кальция в одной клетки HeLa после индукции апоптоза с 0,5 мкМ стауроспорин.

Discussion

Здесь мы представляем очень простой метод измерения митохондриального кальция использованием митохондриальной ориентированных логометрических pericam. Как показано на рисунке 1а, используя стандартные широкопольных оптики, без деконволюции можно легко просматривать отдельные митохондрии в клетках HeLa с приемлемой сигнал-шум. Это потому, что клетки HeLa, как и большинство клеток в культуре, значительно выравниваются, когда приверженец что исключает необходимость в конфокальной микроскопии или другой специализированной техники. Мы нашли аналогичные результаты в клетках Jurkat придерживался поли-лизин покрытием покровные ^8. В отличие от методологии использования красителей, это также возможно для неинвазивного мониторинга митохондриальной уровня кальция в течение нескольких часов с использованием генетически закодированы кальция такие показатели, как логометрических pericam (рис. 1E). Это особенно важно при анализе митохондриальной кальция во время гибели клеток. Кроме того, это также возможно для визуализации деления / фрагментация митохондрий в процессе апоптоза. Как показано на рисунках 1D и Е, стауроспорин лечение вызывает медленное увеличение кальция в отдельных субпопуляций митохондрии которых пики на 20 минут. Кальций уровней спуститься снова одновременно с митохондриальной фрагментации, прежде чем снова через 2 часа после лечения. Это согласуется с медленных волн в цитозольного кальция индуцированных стауроспорин лечения измерялась с помощью Фура-2 ^9. Таким образом, важной кинетической информацию можно получить, что невозможно с методами использования статических измерений. Хотя мы представили отношения, а не кальция концентрации на рисунке 1, можно откалибровать датчик на месте рассчитать абсолютные уровни кальция, ^{4, 10.} Одним из важных предостережение, чтобы рассмотреть, что логометрических pericam чувствителен к рН ^{4, 10.} Так как оба цитозольного и митохондриальной уровнях рН может резко измениться во время апоптоза ^11, это является важным фактором. Титрование рН в изолированных митохондриях выражения pericam демонстрируют, что увеличение [H ^+] увеличивает выброс pericam при возбуждении на 495 нм, при недостаточном эффекте от излучения стимулируется возбуждение при 410 нм, собственность, которая была использована для одновременного измерения как митохондриальной кальций и рН ^12. Таким образом, выборочный контроль выбросов с 410 нм возбуждения предоставляет средства для не-ratiometrically монитор митохондриального кальция со снижением забота о рН. Наконец, протокол, представленные здесь требуется только доступ к стандартным epifluorescent микроскоп с широко доступны фильтры, что делает эту технику доступной для большинства лабораторий.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope		Nikon	MEA53310	Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol.
Imaging Software		Molecular Devices, Inc	Metafluor
Attofluor cell chamber		Invitrogen Corporation	A-7816	Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice.
Lipofectamine 2000		Invitrogen Corporation	11668-019	Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies
MitoTracker Red CMXRos		Invitrogen Corporation	M7512