Derivazione di timica linfoma a cellule T Linee da Atm - / -</sup E P53 - / -</sup Mouse
Summary
In questo video si dimostra un protocollo per stabilire le linee del mouse linfoma delle cellule del timo. Seguendo questo protocollo, abbiamo stabilito con successo diverse linee di cellule T da Atm-/ – e p53-/ – i topi con linfoma del timo.
Abstract
Linee cellulari stabilizzate sono uno strumento di ricerca critica che può ridurre l'uso di animali da laboratorio nella ricerca. Alcuni ceppi di topi geneticamente modificati, come Atm – / – e p53 – / – costantemente sviluppare linfoma timico primi anni di vita 1,2, e quindi, può servire come una fonte affidabile per la derivazione di cellule T murino linee. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per lo sviluppo di linfoma timico stabilito murino linee di cellule T, senza la necessità di aggiungere interleuchine, come descritto in precedenti protocolli 1,3. I tumori sono stati raccolti dai topi di età compresa tra tre a sei mesi, alla prima indicazione di tumori visibili basa sull'osservazione della postura ingobbita, respiro affannoso, governare poveri e sprecare in un 1,4 ceppo sensibile. Abbiamo stabilito con successo diverse linee di cellule T usando questo protocollo e ceppi inbred di Atm – / – [FVB/N- Atm tm1Led / J] 2 e p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 topi. Abbiamo inoltre dimostrato che oltre il 90% della stabilito cellule T popolazione esprime CD3, CD4 e CD8. Coerentemente con le linee cellulari in modo stabile, le T-cellule generate utilizzando il protocollo attuale sono stati diversi passaggi per oltre un anno.
Protocol
Discussion
In questo protocollo, forniamo le procedure particolareggiate per stabilire murino linee di cellule T da due genotipi differenti del mouse; Atm – / – [FVB/N- Atm tm1Led / J] e p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . Usando questo protocollo, per un totale di 6 (su 7 tentativi) Atm – / – e tre (su 5 tentativi) p53 – / – murini linee di cellule T sono state istituite nel nostro laboratorio. Dati rappresen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Boris Reizis del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia presso la Columbia University per le discussioni utili. Desideriamo inoltre ringraziare il Dr. Margaret Bynoe, il Dr. Rodman Getchell e Deequa Mahamed del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia presso il College di Medicina Veterinaria, Cornell University di assistenza tecnica con la citometria a flusso e Huang Lu per l'assistenza con l'editing video. Gli autori desiderano ringraziare i membri del Duhamel e Weiss laboratori per la loro revisione critica del manoscritto e la produzione video, e Stephanie Yazinski dal laboratorio Weiss per l'allevamento e la genotipizzazione p53 – / – topi. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali Cornell Università Istituzionale e del Comitato Usa. Questa ricerca è stata sostenuta in parte dai fondi messi a disposizione dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti, la ricerca sullo stato Cooperativa, Educazione e Extension Service, la salute degli animali e della Ricerca Programma di Disease (a GED e RSW) e le sovvenzioni NIH R03 HD058220 e R01CA108773 (a RSW). Il video è stato prodotto utilizzando strutture in-house dal personale dei laboratori Duhamel & Weiss.
Materials
- Ice bucket
- 70% ethanol
- Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins
- Two sets of small sterile scissors and forceps
- Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13)
- Sterile 18 gauge needles
- 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829)
- 10% buffered formalin
- Tissue culture flasks
- T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025)
- T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075)
- 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506)
- Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS)
- Culture medium
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03)
- 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI)
- 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI)
- 55 mM 2β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752)
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275)
- Antibodies (eBioScience, San Diego, CA)
- anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85)
- anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83)
- anti-CD8-PE (cat.#12-081-85)
- Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017)
- Concanavalin A (Sigma cat# C5275)
- 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)
Referências
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- Elson, A. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).
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