Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

Resumo

Este é um protocolo para preparar e manter uma preparação fatia neocortical na cultura organotípicas com a finalidade de fazer gravações elétrica de neurônios piramidais.

Resumo

Temos vindo a estudar os papéis expressão e funcional de voltagem dependentes canais de potássio em neurônios piramidais do neocórtex de ratos. Devido à falta de agentes farmacológicos específicos para estes canais, temos uma abordagem genética para manipular a expressão do canal. Nós usamos uma preparação cultura organotípicas (16) a fim de manter a morfologia das células eo padrão laminar do córtex. Normalmente, isolar aguda fatias neocortical menos 8-10 dias pós-parto e manter as fatias em cultura por 3-7 dias. Isto permite-nos estudar neurônios em uma idade semelhantes aos de nosso trabalho com fatias aguda e minimiza o desenvolvimento de exuberante conexões excitatórias nos fatia. Nós gravar a partir de visualmente identificados neurônios piramidais em camadas II / III ou V com uma iluminação de infravermelho (IR) e microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) com grampo toda célula patch em corrente ou tensão-clamp. Usamos transfecção (arma Gene) biobalística do tipo selvagem ou mutante DNA canal de potássio para manipular a expressão dos canais para estudar sua função. As células transfectadas são facilmente identificados por microscopia de epifluorescência, após a co-transfecção com cDNA para a proteína verde fluorescente (GFP). Nós comparamos as gravações de células transfectadas com adjacentes, os neurônios untransfected na mesma camada da mesma fatia.

Protocolo

1. Preparativos Antes do dia da Slicing

Acharmos que é mais eficiente para autoclave os instrumentos cirúrgicos e preparar soluções antes do dia de cortar.

1. Instrumentos autoclave. (A cirurgia eo corte são realizados sob condições semi-estéril). Autoclave os seguintes pacotes, embalados individualmente em papel autoclave:
   • Pacote de cirurgia: espátula, # 22 lidar com lâmina de bisturi, tesouras, pinças
   • Pacote de corte: 3 botões (lâmina de retenção de botão e 2 banho de garantir knobs) e lâmina de guarda (mantém lâmina de barbear de slicer: Campden Vibroslice, # MA5....

Discussão

Temos vindo a estudar os papéis expressão e funcional de voltagem dependentes canais de potássio em neurônios piramidais do neocórtex de ratos (4, 9-11). Devido à falta de agentes farmacológicos específicos para estes canais, usamos uma abordagem genética para manipular a expressão do canal (1,14,15,17-19). Nós utilizamos uma preparação organotípicas cultura (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Modificado a partir da abordagem de Stoppini et al (16), a fim de manter a morfologia das células eo padrão laminar do có.......

Materiais

Cirurgia transfecção / / cultura:

1. Cérebro Slicer: Campden Vibroslice # MA572 Instrumentos de Precisão Mundial, Sarasota, FL, EUA
2. Gene Sistema Gun: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
   • Inclui: arma Gene, conjunto de mangueira com regulador de hélio, tubos prep estação (# 165-2418), kit seringa, tubos Tefzel, cortador de tubos, kit de otimização (# 165-2424), cortador de tubulação
   • Bio-Rad Hélio Regulador (# 165-2413)
   • material descartável para Helios da Bio-Rad:
     • 1,6 mM microcarregadores Gold: # 165-2264
     • Tefzel Tubing: # 165-2441
3. Incubadora: Forma Scientific modelo # 3110 (Thermo-científico: (866) 984-3766).

Media:

1. Soro de cavalo: Hyclone doador eqüinos # 30074 SH. (HyClone, 925 Oeste 1800 Sul, Logan, UT 84321)
2. HMEM (Minimal Essential Media mais HBSS e HEPES, sem glutamina: Lonza BioWhittaker Catalog # 12-137F): GIBCO / INVITROGEN, (800) 955-6288, opção 1.
3. HBSS (Hanks GIBCO solução salina, # 24020-117): GIBCO / INVITROGEN, (800) 955-6288, opção 1.
4. MEM (GIBCO meio mínimo essencial, # 12360-038), GIBCO / INVITROGEN, (800) 955-6288, opção 1.
5. 250 mL Millipore 0,2 mm filter: # SC6PU02RE
6. Plástico pipetas de transferência: Fisher # 13-711-20.
7. 50 mL Millipore 0,22 mM steriflip filtro (# SCGP00525)

Itens 6-8 obtido a partir de: Fisher Scientific, 1241 Embaixador Blvd, PO Box 14989, St. Louis, MO 63132.

De gravação:

1. Pipeta de vidro: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 outubro Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
2. Sutter P-87 extrator eletrodo horizontal: Empresa Instrumento Sutter, um Drive Digital, Novato, CA 94949
3. Axon Instruments Multiclamp amplificador 700B: Dispositivos Molecular, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
4. PClamp 10 software de aquisição de dados: Dispositivos Molecular, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
5. lectrode posição é controlada com Sutter ROE-200 manipuladores e PC-200 do controlador: Instrument Company Sutter, um Drive Digital, Novato, CA 94949.
6. Microscópio: Olympus BX-50WI microscópio vertical com IR-DIC óptica
7. IR-sensíveis câmera OLY-150 (Olympus) ou DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 do Norte Roeske Avenue, em Michigan City, IN 46360).