相关的染色体陷阱(ACT)的分析是用于识别远射DNA相互作用的一种新的不带偏见的方法。远距离DNA相互作用的特性,将使我们在正常的生理和患病状态,以确定核架构的关系,基因的表达。
由DNA编码的遗传信息是在一个复杂和高度管制的染色质结构的组织。每个染色体上占据一个特定的领土,这可能会改变的发展阶段或细胞周期。基因表达可出现在专门的转录工厂染色段可能从不同的染色体领土循环,导致合作本地化的DNA片段上可能存在不同的染色体或同一染色体上相距甚远。相关的染色体陷阱(ACT)的检测提供了一种有效的方法来识别这些偏见地远射DNA协会通过扩展和修改的染色体构象捕获技术。 ACT检测使得我们有可能调查的反转录调控机制,可以帮助解释核架构的关系,在正常的生理和在疾病状态下基因表达。
德克尔等人发展的染色体构象捕获(3C)的方法来检测两个1的基因位点之间的互动频率,并已广泛用于3C 调查 2哺乳动物细胞中的两个已知的DNA区域内的染色体和染色体间协会-9。虽然新开发的高- C的方法可用于对全基因组DNA协会的研究应用,使检测位点特异性DNA相互作用10-11的研究仍然是一个有效的技术。我们已经修改了这种方法,识别未知的DNA,在培养的小鼠和人类细胞(图1)已知的DNA区域关联区域。我们命名这个方法相关的染色体陷阱(ACT)的检测,因为它为我们提供了一个可靠和可重复性的方法来识别的一种新的未知的DNA伙伴,与已知的目标DNA区域的12副。一个成功的3C检测与适当的控制是在执行小说方面的ACT检测13之前执行。 tofind为了尽可能多的相关的DNA区域,它是需要使用的各种组合的第一个和第二个限制性内切酶。尤其重要的是使用限制性内切酶,CpG甲基化不敏感执行的第一个3C结扎步骤。蛋白结合和DNA甲基化也可以影响酶切效率,并可能导致对某些限制性内切酶消化相关的DNA区域结扎失败。发生染色体内或跨结扎取决于蛋白质- DNA交联和相关的DNA区域的适当的物理图谱。因此,一些初步的实验,都必须建立在ACT检测一个切实可行的有效的甲醛浓度和处理时间。终浓度的甲醛(from1.5%至2%)的范围已被用于在几个实验室在实验 7,9 3C部分。另外,作为连接器所使用的寡核苷酸,可设计相匹配的第二个限制性内切酶切割的凝聚力结束。虽然我们发现,18日至20日在第一轮PCR和20-25周期,在第二轮的PCR循环,可以提供清晰的条带,它是要建立每个实验(图2)最佳的PCR条件,内部分子之间的5' -端和3' -末端的DNA链可能会发生在PCR的互补适配器序列退火,它能够抑制适配器特异性引物退火的DNA分子,扩增效率低得多,导致前几个周期。循环的扩增目标DNA后,其数额可能远远比这些非特异性反应,并可能有利于引物退火的目标DNA分子的竞争。这也是为什么我们可以看到背景放大,为何第一轮PCR产物进行稀释,以减少背景amplification.It重要的是从PCR反应中删除多余的引物,以减少在第二轮PCR的背景。在所有基于PCR的实验,这是至关重要的,设计引物中不重复序列的区域,这构成了大多数人类和小鼠的DNA位于。虽然新开发的高- C的方法可用于对全基因组DNA协会的研究应用,使检测位点特异性的DNA相互作用的研究仍然是一个有效的技术。
The authors have nothing to disclose.
我们非常感谢阿德尔Murell和沃尔夫Reik分享他们的3C协议。这项工作是由国防部和退伍军人事务部的研究服务部的支持。
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
RPMI1640 medium | Invitrogen | 22400-105 | ||
acrylamide | Invitrogen | 15512-023 | ||
ATP solution, 10mM | Invitrogen | AM8110G | ||
fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | ||
penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
1M Tris pH8.0 | Invitrogen | AM9856 | ||
RNase A | Invitrogen | 12091-039 | ||
SDS | Invitrogen | 15525-017 | ||
urea | Invitrogen | 15505-035 | ||
BamH I | NEB Biolabs | R0136T | ||
Bgl II | NEB Biolabs | R0144M | ||
Dpn II | NEB Biolabs | R0543T | ||
Msp I | NEB Biolabs | R0106S | ||
dNTPs | NEB Biolabs | N0447L | ||
proteinase K | NEB Biolabs | P8102S | ||
T4 DNA ligase | NEB Biolabs | M0202T | ||
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | ||
Bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | ||
dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | ||
glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | ||
PMSF | Sigma-Aldrich | 93482 | ||
proteinase inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830 | ||
Nonidet P-40 | Roche Applied Science | 11754599001 | ||
KlenTaq1 | Ab peptides | 1001 | ||
dCTP alpha P32 | PerkinElmer | BLU513H250UC | ||
PTC-100 Thermal Cycler | MJ Research | mjptc100 | ||
Power Supply | Bio-Rad | 164-5056 | ||
OmniPAGE Maxi | Aurogene Life Science | VS20D | ||
Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-78 |