Die damit verbundenen Chromosom Trap (ACT)-Assay ist ein neuartiges unvoreingenommene Verfahren zur Identifizierung von Langstrecken-DNA-Wechselwirkungen. Die Charakterisierung der Long Range DNA-Wechselwirkungen wird es uns ermöglichen, die Beziehung der nuklearen Architektur, um die Genexpression zu bestimmen, sowohl die normale Physiologie und in krankhaften Zuständen.
Genetische Informationen, die von DNA codiert wird, in einer komplexen und stark regulierten Chromatin-Struktur organisiert. Jedes Chromosom befindet sich in einem bestimmten Gebiet, die nach Stadium der Entwicklung oder Zellzyklus ändern kann. Genexpression kann in spezialisierten transkriptionelle Fabriken dort auftreten, wo Chromatin Segmente Schleife aus verschiedenen Chromosomen Territorien, die zu Co-Lokalisation von DNA-Segmenten, die auf unterschiedlichen Chromosomen oder weit voneinander entfernt auf demselben Chromosom vorhanden sein können. The Associated Chromosome Trap (ACT)-Assay bietet eine effektive Methode, um diese Langstrecken-DNA Verbände in einem unvoreingenommenen Weise durch die Erweiterung und Änderung des Chromosoms Konformation Capture-Technik zu identifizieren. Der ACT-Test macht es uns möglich, Mechanismen der Regulation der Transkription in trans zu untersuchen, und können bei der Erläuterung der Beziehung der nuklearen Architektur, die Genexpression in der normalen Physiologie und während Krankheitszuständen.
Dekker et al. Entwickelte das Chromosom Konformation erfassen Ansatzes (3C), um die Häufigkeit der Interaktion zwischen zwei genomischen Loci 1 zu erfassen, und 3C wurde ausgiebig auf intra-chromosomale und inter-chromosomal Assoziationen zwischen zwei bekannten DNA-Regionen in Säugetier-Zellen 2 zu untersuchen verwendet -9. Obwohl neu entwickelten Hallo-C Methodik zur Untersuchung der genomweiten DNA Verein aufgebracht werden können, ist ACT-Test noch eine effektive Technik zur Untersuchung von Locus-spezifischen DNA-Interaktion 10-11. Wir haben diesen Ansatz modifiziert werden, um unbekannte DNA Regionen, die mit einer bekannten DNA-Region in kultivierten Maus und humanen Zellen (Abbildung 1) verbunden sind, zu identifizieren. Wir nannten diese Methode der damit verbundenen Chromosom Trap (ACT)-Assay, da es uns eine verlässliche und reproduzierbare Methode, um neue unbekannte DNA-Partnern, die mit einem bekannten Ziel-DNA Bereich 12 Mitarbeiter zu identifizieren. Eine erfolgreiche 3C-Assay mit geeigneten Kontrollen wird vor der Ausführung der neuartigen Aspekte der ACT-Test 13 durchgeführt. Um möglichst viele zugehörige DNA-Regionen wie möglich tofind, ist es notwendig, verschiedene Kombinationen der ersten und zweiten Restriktionsenzyme verwenden. Es ist besonders wichtig, Restriktionsenzyme, die unempfindlich gegen CpG-Methylierung auf den ersten 3C Ligationsschritt durchführen verwenden. Protein-Bindung und DNA-Methylierung können auch Einfluss Restriktionsenzymverdau Effizienz und kann zum Ausfall der Ligation der damit verbundenen DNA-Bereiche für bestimmte Restriktionsenzym Aufschlüsse führen. Das Auftreten von intra-oder inter-chromosomal Ligation ist abhängig von Protein-DNA-Vernetzung und entsprechende physische Karten von beiden der zugehörigen DNA-Regionen. So sind einige Vorversuche notwendig, um eine praktikable wirksame Formaldehyd-Konzentration und Behandlungsdauer in der ACT-Tests erstellen. Eine Reihe von Endkonzentrationen von Formaldehyd (from1.5% bis 2%) wurden in mehreren Labors wurde während der 3C Teil des Tests 7,9 verwendet. Alternativ können die Oligonukleotide als Linker verwendet entworfen, um den Zusammenhalt Ende durch den zweiten Restriktionsenzym geschnitten angepasst werden. Obwohl wir festgestellt, dass 18-20 Zyklen in der ersten Runde der PCR und 20-25 Zyklen in der zweiten Runde der PCR konnten deutliche Banden liefern, ist es notwendig, die beste PCR-Bedingungen für jedes Experiment (Abbildung 2) zu etablieren. Intra-Molekül Glühen zwischen 5'-Ende und 3'-Ende komplementär Adapter Sequenz eines DNA-Stranges kann in PCR auftreten, hemmt es Adapter-spezifischen Primer mit den DNA-Molekül, und führte zu viel niedrigeren Amplifikationseffizienz in der ersten mehreren Zyklen. Nachdem die Ziel-DNA für die Zyklen amplifiziert wurde, kann ihre Höhe sehr viel größer sein als diese unspezifischen Reaktionen und kann der Konkurrenz der Primer an die Target-DNA-Moleküle zu erleichtern. Dies gilt auch, warum wir Hintergrundamplifikation sehen kann, und warum die erste Runde PCR-Produkt muss verdünnt Hintergrund amplification.It zu verringern ist wichtig, um überschüssige Primer aus der PCR-Reaktion zu entfernen, um den Hintergrund in die zweite Runde der PCR verringern. Wie in allen PCR-Experimenten, ist es wichtig, Primer, die nicht in Repeat-Sequenz Regionen, die die Mehrheit der Menschen und der Maus DNA bilden befinden Design. Obwohl neu entwickelten Hallo-C Methodik zur Untersuchung der genomweiten DNA Verein aufgebracht werden können, ist ACT-Test noch eine effektive Technik zur Untersuchung von Locus-spezifischen DNA-Interaktion.
The authors have nothing to disclose.
Wir bedanken uns Adelle Murell und Wolf Reik sehr viel für die gemeinsame Nutzung ihrer 3C-Protokoll. Diese Arbeit wurde vom Department of Defense und dem Research Service des Department of Veterans Affairs unterstützt.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
RPMI1640 medium | Invitrogen | 22400-105 | ||
acrylamide | Invitrogen | 15512-023 | ||
ATP solution, 10mM | Invitrogen | AM8110G | ||
fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | ||
penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
1M Tris pH8.0 | Invitrogen | AM9856 | ||
RNase A | Invitrogen | 12091-039 | ||
SDS | Invitrogen | 15525-017 | ||
urea | Invitrogen | 15505-035 | ||
BamH I | NEB Biolabs | R0136T | ||
Bgl II | NEB Biolabs | R0144M | ||
Dpn II | NEB Biolabs | R0543T | ||
Msp I | NEB Biolabs | R0106S | ||
dNTPs | NEB Biolabs | N0447L | ||
proteinase K | NEB Biolabs | P8102S | ||
T4 DNA ligase | NEB Biolabs | M0202T | ||
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | ||
Bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | ||
dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | ||
glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | ||
PMSF | Sigma-Aldrich | 93482 | ||
proteinase inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830 | ||
Nonidet P-40 | Roche Applied Science | 11754599001 | ||
KlenTaq1 | Ab peptides | 1001 | ||
dCTP alpha P32 | PerkinElmer | BLU513H250UC | ||
PTC-100 Thermal Cycler | MJ Research | mjptc100 | ||
Power Supply | Bio-Rad | 164-5056 | ||
OmniPAGE Maxi | Aurogene Life Science | VS20D | ||
Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-78 |