관련된 염색체 트랩 (ACT) 분석은 장거리 DNA 상호 작용을 확인하는 소설 편견 방법입니다. 장거리 DNA 상호 작용의 특성은 우리가 정상적인 생리 모두와 질병 상태에서 유전자 발현에 핵 건축의 관계를 확인할 수 있습니다.
DNA로 인코딩된 유전 정보는 복잡하고 고도의 규제 염색질 구조로 구성됩니다. 각각의 염색체는 개발 또는 세포주기의 단계에 따라 변경될 수 있습니다 특정 지역을 차지하고 있습니다. 유전자 발현은 전문 transcriptional 공장에서 발생할 수있는 염색질 세그먼트가 동일한 염색체에 멀리 떨어져 서로 다른 염색체 또는 존재할 수있는 DNA 세그먼트의 공동 현지에 이르는 다양한 염색체 지역에서 루프 밖으로 수 있습니다. 연결된 염색체 트랩 (ACT) 분석은 염색체 형태 캡처 기술을 확장하고 수정하여 편견 방식으로 이러한 장거리 DNA 연결을 확인하는 효과적인 방법을 제공합니다. ACT의 분석은 우리가 트랜스의 transcriptional 규제의 메커니즘을 조사하는 것이 가능하게하고, 정상적인 생리학 및 질병 상태 동안 유전자 발현에 핵 건축의 관계를 설명할 수 있습니다.
데커 외가. 2 게놈 loci 1 사이의 상호 작용의 빈도를 감지하는 염색체 형태 캡처 (3C) 접근 방법을 개발하고, 3C는 포유 동물 세포이의 두 알려진 DNA 영역간에 내부 염색체 간 염색체 연관 관계를 조사하기 위해 광범위하게 사용되고 있습니다 -9. 새로 개발된 하이 – C 방법론은 게놈 전체 DNA 협회 연구를위한 적용할 수 있지만, ACT 분석은 여전히 로커스 특정 DNA 상호 작용 10-11의 연구를위한 효과적인 기술입니다. 우리는 교양 마우스와 인간의 세포 (그림 1)에서 알려진 DNA 영역과 관련된 알 수없는 DNA 영역을 식별하는 데이 방법을 수정했습니다. 그것이 우리에게 알려진 타겟 DNA 지역 12 연관 소설 알 수없는 DNA 파트너를 식별하는 신뢰성과 재현성 방법을 제공으로 우리는 관련된 염색체 트랩 (ACT) 분석이 방법을 지명했다. 적절한 컨트롤과 함께 성공적인 3C 분석은 ACT 분석 13 소설 측면을 실행하기 전에 수행됩니다. 가능한 많은 관련 DNA 영역으로 tofind 위해서는 첫 번째와 두 번째 제한 효소의 다양한 조합을 사용해야합니다. 그것은 최초의 3C 내고 단계를 수행하는 CPG methylation을 구별 제한 효소를 사용하는 특히 중요합니다. 단백질 결합과 DNA의 methylation은 또한 제한 효소 소화 효율에 영향을 미칠 수 있으며 특정 제한 효소 digestions에 대한 관련 DNA 영역의 결합의 실패로 이어질 수 있습니다. 내부 또는 상호 염색체 결합의 발생은 단백질 DNA 상호 연결과 관련된 DNA 지역 모두의 적절한 물리적지도에 따라 달라집니다. 따라서, 일부 예비 실험 ACT 분석에 사용할 수있는 효과적인 포름 알데히드 농도 및 처리 시간을 설정하는 데 반드시 필요합니다. 포름 알데히드 (from1.5 % 2 %)의 최종 농도의 범위는 분석 7,9의 3C 부분 동안 여러 실험실에서 사용되었습니다. 또는, linkers으로 사용 oligonucleotides는 두 번째 제한 효소로 잘라 응집 끝에 일치하도록 설계할 수 있습니다. 우리가 PCR의 두 번째 라운드에서 PCR과 20-25 사이클의 첫 번째 라운드에서 18-20 순환 분명히 밴드를 제공할 수있는 것을 발견하지만, 각 실험 (그림 2)에 대한 최고의 PCR 조건을 확립하는 것이 필요합니다. 내부 분자 DNA의 가닥이 PCR에서 발생할 수의 5' 엔드 및 3' – 최종 보완 어댑터 시퀀스 사이의 어닐링, 그것은 DNA 분자와 어닐링 어댑터 특정 뇌관을 억제하고, 처음 몇주기에서 훨씬 낮은 증폭 효율의 결과. 대상 DNA가주기에 대한 증폭 이후, 그 금액이 특이 현상이 반응보다 훨씬 클 수 있으며, 프라이머가 대상 DNA 분자로 어닐링의 경쟁을 촉진 수도 있습니다. 우리가 배경 증폭을보고, 왜 첫 라운드 PCR 제품은 PCR의 두 번째 라운드에서 배경을 감소하기 위해 PCR 반응에서 초과 primers를 제거하는 것이 중요합니다 배경 amplification.It을 감소 희석되어야 할 이유가 이것도 있습니다. 모든 PCR 기반의 실험에서와 마찬가지로, 그것은 인간 및 마우스의 DNA의 대부분을 구성하고 반복 시퀀스 지역에 거주하지 primers를 설계하는 것이 매우 중요합니다. 새로 개발된 하이 – C 방법론은 게놈 전체 DNA 협회 연구를위한 적용할 수 있지만, ACT 분석은 여전히 로커스 특정 DNA의 상호 작용 연구를위한 효과적인 기술입니다.
The authors have nothing to disclose.
우리가 그들의 3C 프로토콜을 공유하기위한 대단히 아델 무렐와 늑대 Reik 감사합니다. 이 작품은 국방부와 재향 군인의 담당 부서의 연구 서비스의 부서에 의해 지원되었다.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
RPMI1640 medium | Invitrogen | 22400-105 | ||
acrylamide | Invitrogen | 15512-023 | ||
ATP solution, 10mM | Invitrogen | AM8110G | ||
fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | ||
penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
1M Tris pH8.0 | Invitrogen | AM9856 | ||
RNase A | Invitrogen | 12091-039 | ||
SDS | Invitrogen | 15525-017 | ||
urea | Invitrogen | 15505-035 | ||
BamH I | NEB Biolabs | R0136T | ||
Bgl II | NEB Biolabs | R0144M | ||
Dpn II | NEB Biolabs | R0543T | ||
Msp I | NEB Biolabs | R0106S | ||
dNTPs | NEB Biolabs | N0447L | ||
proteinase K | NEB Biolabs | P8102S | ||
T4 DNA ligase | NEB Biolabs | M0202T | ||
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | ||
Bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | ||
dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | ||
glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | ||
PMSF | Sigma-Aldrich | 93482 | ||
proteinase inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830 | ||
Nonidet P-40 | Roche Applied Science | 11754599001 | ||
KlenTaq1 | Ab peptides | 1001 | ||
dCTP alpha P32 | PerkinElmer | BLU513H250UC | ||
PTC-100 Thermal Cycler | MJ Research | mjptc100 | ||
Power Supply | Bio-Rad | 164-5056 | ||
OmniPAGE Maxi | Aurogene Life Science | VS20D | ||
Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-78 |