La trampa de cromosoma asociados (ACT) de ensayo es un nuevo método imparcial para la identificación de largo alcance interacciones ADN. La caracterización de las interacciones de largo alcance de ADN nos permitirá determinar la relación de la arquitectura nuclear de la expresión génica en la fisiología normal y en estados de enfermedad.
La información genética codificada por el ADN está organizado en una estructura de la cromatina complejo y altamente regulado. Cada cromosoma ocupa un territorio específico, que puede variar de acuerdo a la etapa de desarrollo o del ciclo celular. La expresión de genes puede ocurrir en las fábricas especializadas en los segmentos de la transcripción de la cromatina puede salida en lazo de los territorios de varios cromosomas, dando lugar a la co-localización de segmentos de ADN que pueden existir en diferentes cromosomas o muy separados en el mismo cromosoma. La trampa de cromosomas asociados (ACT) de ensayo proporciona una metodología eficaz para identificar el ADN de estas asociaciones a largo plazo de una manera imparcial mediante la ampliación y modificación de la conformación técnica de captura de los cromosomas. La prueba ACT hace posible para nosotros para investigar los mecanismos de regulación transcripcional en trans, y puede ayudar a explicar la relación de la arquitectura nuclear de la expresión de genes en la fisiología normal y durante estados de enfermedad.
Dekker et al. Desarrolló la conformación de los cromosomas de captura (3C) método para detectar la frecuencia de interacción entre dos loci del genoma 1 y 3C se ha utilizado ampliamente para investigar las asociaciones intra-e inter-cromosómicas cromosómicas entre dos regiones de ADN en células de mamíferos conocidos 2 -9. Aunque de nuevo desarrollo Hi-C metodología puede ser aplicada para el estudio de todo el genoma de ADN asociación, ensayo ACT es todavía una técnica eficaz para el estudio de la interacción de ADN específica de locus 10-11. Hemos modificado este enfoque para identificar las regiones desconocidas de ADN que están asociados con una región de ADN conocidos en el ratón y células humanas cultivadas (Figura 1). Hemos llamado a este método la trampa cromosómicas asociadas (ACT) de ensayo, ya que nos proporciona un método fiable y reproducible para identificar nuevos socios de ADN desconocido que se asocian con una zona piloto de ADN que se sabe 12. Un ensayo con éxito 3C con los controles adecuados se realiza antes de la ejecución de los aspectos novedosos de la prueba ACT 13. Con el fin de tofind como muchas regiones de ADN asociadas como sea posible, es necesario el uso de varias combinaciones de enzimas de restricción primera y segunda. Es especialmente importante la utilización de enzimas de restricción que son sensibles a la metilación CpG para llevar a cabo el primer paso para la ligadura de 3C. La unión a proteínas y la metilación del ADN también pueden influir en la eficiencia de la enzima de restricción digestión y puede conducir al fracaso de la ligadura de las regiones de ADN asociadas a ciertas digestiones con enzimas de restricción. La aparición de la ligadura de intra o inter-cromosómica depende de la proteína-ADN de entrecruzamiento y apropiado mapas físicos de las dos regiones de ADN asociadas. Por lo tanto, algunos experimentos preliminares son esenciales para establecer una concentración de formaldehído eficaz posible y el tiempo de tratamiento en el ensayo de ACT. Una gama de concentraciones finales de formaldehído (from1.5% a 2%) se han utilizado en varios laboratorios en la parte de 3C de la prueba de 7,9. Por otra parte, los oligonucleótidos utilizados como enlaces pueden ser diseñados para coincidir con el extremo cohesivo cortado por la enzima de restricción segundos. Aunque se encontró que los ciclos de 18-20 en la primera ronda de PCR y los ciclos de 20-25 en la segunda ronda de PCR podría proporcionar bandas claras, es necesario establecer las mejores condiciones de PCR para cada experimento (Figura 2). Intra-molécula recocido entre la secuencia del adaptador extremo 5 'y 3' final complementaria de una cadena de ADN puede ocurrir en la PCR, que inhibe específica del adaptador de primer recocido con la molécula de ADN, y dio lugar a la eficiencia de amplificación mucho menor en el primero de varios ciclos. Después de la meta de ADN fue amplificado por ciclos, su cantidad puede ser mucho mayor que estas reacciones no específicas, y puede facilitar la competencia de primer recocido a las moléculas de ADN diana. Esta es la razón por la que podemos ver a la amplificación de fondo, y por qué el producto la primera ronda de PCR tiene que ser diluida para disminuir amplification.It de fondo es importante para eliminar el exceso de cebadores de la reacción de PCR con el fin de disminuir el fondo en la segunda ronda de PCR. Como en todos los experimentos basados en la PCR, es de vital importancia el diseño de cebadores que no se encuentran en las regiones de secuencia de repetición, que constituyen la mayoría del ADN humano y el ratón. Aunque de nuevo desarrollo Hi-C metodología puede ser aplicada para el estudio de todo el genoma de ADN asociación, ensayo ACT es todavía una técnica eficaz para el estudio de la interacción de ADN específica de locus.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Adelle Murell y Reik Lobo mucho por compartir su protocolo 3C. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Defensa y el Servicio de Investigación del Departamento de Asuntos de Veteranos.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
RPMI1640 medium | Invitrogen | 22400-105 | ||
acrylamide | Invitrogen | 15512-023 | ||
ATP solution, 10mM | Invitrogen | AM8110G | ||
fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | ||
penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
1M Tris pH8.0 | Invitrogen | AM9856 | ||
RNase A | Invitrogen | 12091-039 | ||
SDS | Invitrogen | 15525-017 | ||
urea | Invitrogen | 15505-035 | ||
BamH I | NEB Biolabs | R0136T | ||
Bgl II | NEB Biolabs | R0144M | ||
Dpn II | NEB Biolabs | R0543T | ||
Msp I | NEB Biolabs | R0106S | ||
dNTPs | NEB Biolabs | N0447L | ||
proteinase K | NEB Biolabs | P8102S | ||
T4 DNA ligase | NEB Biolabs | M0202T | ||
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | ||
Bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | ||
dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | ||
glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | ||
PMSF | Sigma-Aldrich | 93482 | ||
proteinase inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830 | ||
Nonidet P-40 | Roche Applied Science | 11754599001 | ||
KlenTaq1 | Ab peptides | 1001 | ||
dCTP alpha P32 | PerkinElmer | BLU513H250UC | ||
PTC-100 Thermal Cycler | MJ Research | mjptc100 | ||
Power Supply | Bio-Rad | 164-5056 | ||
OmniPAGE Maxi | Aurogene Life Science | VS20D | ||
Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-78 |