Ilişkili kromozom tuzak (ACT) tayini uzun menzilli DNA etkileşimleri belirlemek için bir romanı tarafsız bir yöntemdir. Uzun menzilli DNA etkileşimleri karakterizasyonu gen ekspresyonu normal fizyoloji hem de hastalıklı devletlerin nükleer mimari ilişkiyi belirlemek için izin verecektir.
Genetik bilgi DNA tarafından kodlanan karmaşık ve oldukça düzenli bir kromatin yapısı içinde organize edilir. Her kromozom, geliştirme veya hücre döngüsü evresine göre değişebilir belirli bir bölge, kaplar. Gen ifadesi, özel transkripsiyonel fabrikalarda oluşabilir uzak aynı kromozom üzerinde farklı kromozomlar veya mevcut DNA segmentleri co-lokalizasyon kromatin segmentlerinde lider, çeşitli kromozom topraklarından döngü çıkışı. Associated Kromozom Trap (ACT), tahlil, tarafsız bir biçimde uzanan ve kromozom konformasyon yakalama tekniğini değiştirerek bu uzun menzilli DNA dernekler tanımlamak için etkili bir yöntem sağlar. ACT testi trans transkripsiyonel düzenleme mekanizmalarının araştırılması için mümkün kılar ve normal fizyoloji ve hastalık durumlarında sırasında nükleer mimarisi gen ekspresyonu arasındaki ilişkiyi açıklamaya yardımcı olabilir.
Dekker ve arkadaşları, iki genomik lokusların 1 arasındaki etkileşimi frekansı tespit etmek için kromozom konformasyon yakalama (3C) yaklaşımı geliştirdi ve 3C, memeli hücrelerinde 2 bilinen iki DNA bölgeleri arasında, intra-kromozomal ve inter-kromozomal dernekler araştırmak için yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır -9. Hi-C yeni geliştirilen metodoloji genom DNA dernek çalışması için uygulanabilir olsa da, ACT testinin hala lokus spesifik DNA etkileşimi 10-11 çalışması için etkili bir tekniktir . Biz bu yaklaşımı, kültürlü, fare ve insan hücreleri (Şekil 1) bilinen bir DNA bölgesi ile ilgili bilinmeyen DNA bölgeleri belirlemek için değiştirdiniz. Biz, bize bilinen bir hedef DNA bölgesi 12 ile ilişkilendirmek roman bilinmeyen DNA ortakları belirlemek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem olarak ilişkili kromozom tuzak (ACT) testi bu yöntem adında . ACT testinin 13 roman yönlerini çalıştırmadan önce gerekli kontrolleri ile başarılı bir 3C tahlil yapılır. Mümkün olduğunca çok sayıda ilgili DNA bölgeleri olarak tofind amacıyla, birinci ve ikinci kısıtlama enzimlerin çeşitli kombinasyonları kullanmak için gerekli. Bu, ilk 3C ligasyonu adımı gerçekleştirmeniz CpG metilasyon duyarsız restriksiyon enzimleri kullanmak için özellikle önemlidir. Protein bağlama ve DNA metilasyon kısıtlama enzim sindirimi verimliliği etkileyen ve belli bir restriksiyon enzimi sindirimler için ilgili DNA bölgeleri ligasyonu yetmezliğine yol açabilir. Intra-ve inter-kromozomal ligasyonu oluşumu, protein-DNA çapraz bağlama ve ilgili DNA bölgeleri hem de uygun fiziksel haritalar bağlıdır. Bu nedenle, bazı ön deneyler ACT testinin uygulanabilir bir etkin formaldehit konsantrasyonu ve tedavi süresi kurmak için gerekli. Formaldehit (from1.5% 2%) son konsantrasyonlarda bir dizi sırasında çeşitli laboratuvarlarında tahlil 7,9 3C kısmı kullanılmıştır. Alternatif olarak, linkers olarak kullanılan oligonükleotidler ikinci restriksiyon enzimi ile kesilen yapışkan son maç için dizayn edilebilir. 18-20, ikinci turda PCR PCR ve 20-25 döngüleri ilk turda döngüleri açık bantları sağlayabilir bulundu rağmen, her bir deney (Şekil 2) için en iyi PCR koşulları kurmak için gerekli. Molekül içi 5'-end ve 3'-ucundaki tamamlayıcı bir DNA iplikçik PCR oluşabilir adaptörü dizisi arasındaki tavlama, DNA molekülü ile tavlama adaptörü özel astar engeller ve ilk birkaç döngüleri çok düşük amplifikasyon verimliliğini sonuçlandı. Döngüleri için hedef DNA amplifiye sonra, miktarı bu nonspesifik reaksiyonlar çok daha büyük olabilir ve astar hedef DNA molekülleri tavlama rekabet kolaylaştırabilir. Arka plan amplifikasyon ve neden ilk turda PCR ürünü, PCR ikinci turda arka plan azaltmak için PCR reaksiyonu fazla primerleri kaldırmak için önemli arka plan amplification.It azaltmak için seyreltilerek neden bu aynı zamanda. PCR tabanlı tüm deneylerde olduğu gibi, insan ve fare DNA çoğunluğu oluşturan Tekrar dizisi bölgelerinde bulunmayan primerler tasarımı için hayati önem taşımaktadır. Hi-C yeni geliştirilen metodoloji genom DNA dernek çalışması için uygulanabilir olsa da, ACT testinin hala lokus spesifik DNA etkileşimi çalışması için etkili bir tekniktir.
The authors have nothing to disclose.
Biz onların 3C protokol paylaşımı için çok Adelle Murell ve Kurt Reik teşekkürler. Bu çalışma ve Gazi İşleri Departmanı Araştırma Servisi Savunma Bakanlığı tarafından desteklenmiştir.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
RPMI1640 medium | Invitrogen | 22400-105 | ||
acrylamide | Invitrogen | 15512-023 | ||
ATP solution, 10mM | Invitrogen | AM8110G | ||
fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | ||
penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
1M Tris pH8.0 | Invitrogen | AM9856 | ||
RNase A | Invitrogen | 12091-039 | ||
SDS | Invitrogen | 15525-017 | ||
urea | Invitrogen | 15505-035 | ||
BamH I | NEB Biolabs | R0136T | ||
Bgl II | NEB Biolabs | R0144M | ||
Dpn II | NEB Biolabs | R0543T | ||
Msp I | NEB Biolabs | R0106S | ||
dNTPs | NEB Biolabs | N0447L | ||
proteinase K | NEB Biolabs | P8102S | ||
T4 DNA ligase | NEB Biolabs | M0202T | ||
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | ||
Bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | ||
dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | ||
glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | ||
PMSF | Sigma-Aldrich | 93482 | ||
proteinase inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830 | ||
Nonidet P-40 | Roche Applied Science | 11754599001 | ||
KlenTaq1 | Ab peptides | 1001 | ||
dCTP alpha P32 | PerkinElmer | BLU513H250UC | ||
PTC-100 Thermal Cycler | MJ Research | mjptc100 | ||
Power Supply | Bio-Rad | 164-5056 | ||
OmniPAGE Maxi | Aurogene Life Science | VS20D | ||
Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-78 |