Hier laten we zien hoe Proximity Ligatie Assay (PLA), te gebruiken met een combinatie van antilichamen tegen botmorfogenetisch Protein (BMP) signalering in vaste cellen te visualiseren. Deze techniek liet ons toe om de nucleaire accumulatie van endogene BMP geactiveerde effector-complexen te volgen en hun niveaus loop van de tijd te kwantificeren onder BMP4 stimulatie.
BMP's zijn verantwoordelijk voor een breed scala aan ontwikkelings-en biologische effecten. BMP receptoren te activeren (fosforyleren) de Smad1/5/8 effectoren, die vervolgens, een complex vormen met Smad4 en verplaatsen naar de kern waar zij fungeren als transcriptiefactoren naar BMP specifieke downstream effecten 1 te starten. Traditionele immuno-fluorescentie technieken met antilichamen tegen fosfo-Smad peptiden vertonen een lage gevoeligheid, hoge achtergrond en bieden grove kwantificering als ze vertrouwen op de intensiteit van het antilichaam-signaal in het bijzonder als deze is lichtgevoelig fluorescerende. Daarbij mag fosfo-Smads niet allemaal in complex met Smad4 en betrokken in actieve transcriptie.
In situ PLA is een technologie voor het opsporen van eiwit-interacties met hoge specificiteit en gevoeligheid 2-4. Deze nieuwe technologie koppels antilichaam erkenning met de amplificatie van DNA surrogaat van het eiwit. Het genereert een gelokaliseerde, discrete signaal in een vorm van vlekken waaruit de exacte positie van de erkenning evenement. Het aantal signalen kunnen worden geteld en vergeleken het verstrekken van een meting. We pasten in situ PLA, het gebruik van de duoLink kit, met een combinatie van antilichamen die de detectie van de BMP signalisatie effectoren phospho-Smad1/5/8 en Smad4 laat alleen wanneer deze in de nabijheid dwz in een complex, dat zich alleen voordoet bij signalering activering. Dit mag voor de eerste keer, de visualisatie en het meten van endogene BMP signalering met een hoge specificiteit en gevoeligheid in een tijdsverloop experiment onder BMP4 stimulatie.
De visualisatie van eiwitcomplexen in situ is een grote vraag, met name voor studies in signaleren waar eiwit interactie en eiwitmodificatie zijn de middelen die cellen gebruiken voor het verzenden van een signaal van het oppervlak naar de kern. Het is niet mogelijk te visualiseren en complexen tussen de twee endogene eiwitten te kwantificeren in situ met immunofluorescentie voor. Co-lokalisatie van antilichamen vertoont een lage resolutie en kunnen niet worden gebruikt om echte interactie te visualiseren. PLA is een nieuwe techniek die onderzoekers zijn begonnen met in verschillende systemen met groot succes 6, 7. Hier laten we zien hoe van PLA niet alleen gebruiken om te visualiseren, maar ook te kwantificeren endogene complexen tussen Smad effectoren stroomafwaarts geactiveerd van BMP stimulatie in de tijd. We gebruikten verschillende weefselcultuurcellen waaronder Neuro2a en vertrouwde op commerciële antilichamen die zijn opgewekt in verschillende soorten (muis een-Smad4 en konijn aP-Smad1/5/8) om dit (fig. 1) te bereiken. Deze methode liet ons, voor de eerste keer, om de activering van BMP effector-complexen te zien na verloop van tijd en niet alleen de aanwezigheid van de gefosforyleerd Smad1/5/8, die niet allen in actieve complexen worden ingezet met Smad4. We telden de signalen (fig. 1F) en vergeleek de meting met de kwantificering verkregen uit immunoblot van dezelfde cellen 8 (figuur 1G). We tot de conclusie dat het aantal plekken een nauwkeurige vergelijkende meting van signalering niveaus loop van de tijd te geven. De techniek werd ook toegepast op andere cellijnen (HEK293T en COS7) met vergelijkbare resultaten (gegevens niet getoond).
Het principe van de technologie is gebaseerd op twee unieke probes die bij de duoLink kit. Elke PLA sonde bestaat uit een secundair antilichaam gekoppeld aan een unieke synthetische oligonucleotide, die fungeert als verslaggever. De nabijheid van de sondes kunnen DNA ligatie op de exacte locatie waar deze probes zijn bevestigd in de nabijheid. De afstand van de oligonucleotiden, die het mogelijk maakt DNA hybridisatie en ligatie is klein (<40nm) en dus kunnen alleen eiwitten die een interactie aangaan toelaten ligatie. Het geligeerde DNA kan dan worden versterkt en gedetecteerd met hybridisatie van gelabelde oligonucleotiden van het geamplificeerde volgorde. De versterking is specifiek omdat het afhankelijk is van DNA-DNA hybridisatie principes en zorgt ook voor hoge gevoeligheid als het geligeerde DNA wordt versterkt verscheidene malen resulteerde in verbetering van de initiële ligatie evenement. Het geamplificeerde DNA wordt gedetecteerd door hybridisatie met gelabelde oligonucleotiden en produceert een zichtbaar en vrij grote vlek. Omdat de vlekken kunnen worden geteld, de PLA-signaal levert niet alleen de exacte ruimtelijke informatie (de locatie van de interactie gebeurtenissen), maar ook een objectieve manier te kwantificeren deze gebeurtenissen 2-4.
Andere technieken die worden toegepast voor de detectie van eiwit-interacties zijn co-immunoprecipitatie, immunofluoresence en TL Resonance Energy Transfer (FRET). Co-immunoprecipitatie assays worden veel gebruikt waardoor de isolatie van eiwitcomplexen. De methode wordt begeleid door immunoblotting, wat betekent dat de eiwitten moet worden uitgedrukt op een relatief hoog niveau om te worden gedetecteerd. Probleem van de hoge achtergrond of niet-specifieke binding van een aantal eiwitten om de kralen zijn soms moeilijk te overwinnen in co-immunoprecipitatie. Daarnaast is co-immunoprecipitatie testen kan de detectie van proteïnen die deel kunnen uitmaken van een eiwit complex zijn, maar kunnen geen onderscheid maken degenen die in zeer dichte nabijheid interactie fysiek met elkaar. Verder kan co-immunoprecipitaties geen kwantificatie in enkele cel resolutie of informatie over de lokalisatie van het eiwit complexen in de cel. Detectie van co-existentie van eiwitcomplexen in een cel of een cel compartiment door immunofluoresence is gebaseerd op de overlap van diffuse signalen en daarom, heeft een lage ruimtelijke resolutie en kan geen nauwkeurige informatie over eiwit interacties. Kwantificering van de immunofluoresence signaal kan worden gedaan door middel van visuele schatting alleen als het verschil is verscheidene malen, en kan niet worden nauwkeurig of meetbaar zijn als de PLA plekken. FRET kan de visualisatie van eiwitcomplexen in levende cellen en overwint de noodzaak voor antilichamen en de blootstelling van de epitoop. Echter, FRET hangt meestal af van de overexpressie van kunstmatige gefuseerde eiwitten, die niet kunnen weerspiegelen de endogene eiwit complexen als in de PLA.
Het blokkeren van de omstandigheden in de PLA protocol zijn kritisch als antilichaam aggregatie kan voorkomen en verhoging van de achtergrond. Alternatieve blokkering voorwaarden zijn te vinden in antilichaam product sheets. Passende controles met primaire en secundaire antilichaam weglating informatie verschaffen over wat kan mis zijn gegaan en ze moeten altijd worden opgenomen. Het is belangrijk om het scherm verschillende antilichamen die de minste achtergrond als ze alleen zijn gebruikt en de beste signaal zal geven als ze samen zijn. Fixatie van de cells is kritisch als over de vaststelling kan leiden eiwitcomplexen volledig te denatureren en af te breken, overwegende dat onvoldoende fixatie kan tot verlies van eiwitcomplexen leiden tijdens de stappen van de procedure. Dit kan worden gecontroleerd door het verlagen van de concentratie van de fixeermiddel tot 3%, of door het beperken van de fixatie tijd. Echter, de fixatie is ook afhankelijk van de vraag of de primaire antilichamen herkennen gedenatureerde eiwitten of niet. Omdat de PLA techniek is erg gevoelig, is speciale zorg nodig om de incubatie tijden en micro-condities gelijk tussen de verschillende monsters te houden.
De monsters moeten niet worden overgelaten drogen bij elk geval vóór de laatste stap. Het drogen van de monsters kan leiden tot een verhoogde achtergrond. De volledige verwijdering van de blokkering oplossing is ook cruciaal om op de achtergrond te voorkomen. Het wassen buffers moet altijd op kamertemperatuur gebracht voor gebruik als lage temperatuur vertraagt de enzymatische reacties. Voor verdere probleemoplossing Raadpleeg de handleiding van de kit.
Het is handig om vlekken te gebruiken om de sub-cellulaire lokalisatie van de PLA-signaal (bijv. DAPI, actine etc) vast te stellen. Hier hebben we gebruikt DAPI (in de montage medium) om de kernen vlek. PLA is compatibel met het gebruik van immunofluorescentie met antilichamen tegen celtype of cellulaire compartiment (hier niet afgebeeld) te bepalen. Accurate kwantificering kan worden gedaan door het tellen van de signalen en het gebruik van specifieke software (duoLink Image Tool, Olink Biosience).
Tot slot hebben we laten zien hoe om te gebruiken in situ PLA, met behulp van de duoLink kit op te sporen BMP signalisatie in vaste cellen en presenteerde haar voordelen: eenvoudig in gebruik, zeer gevoelige, geen achtergrond, en een unieke mogelijkheid om actief te kwantificeren BMP signalering in situ.
De beperking van het toepassen van deze techniek om verschillende eiwit interacties te bestuderen is afhankelijk van de beschikbaarheid en kwaliteit van de primaire antilichamen die de eiwitten herkennen in onderzoek.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek wordt gefinancierd door de MRC en de BBSRC subsidies. Wij danken Agata Zieba en Katerina pardalis in Lab Ulf Landegren's, Uppsala University voor het helpen met het opzetten van de techniek en nuttige adviezen. Olink Biosience voor technische hulp en de presentatie.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
GMEM | Invitrogen | 21710025 | ||
DMEM | Invitrogen | 21063029 | ||
FBS | AutogenBioclear | 7.01 | ||
Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11149068 | ||
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | ||
Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-054 | ||
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | ||
16-well chamber slides | Lab-Tek | 178599 | ||
Polysine | VWR | 631-0107 | ||
Cover glass | VWR | 631-0138 | ||
a-pSmad1/5/8 | Cell Signaling | 9511 | ||
a-Smad4 (B8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7966 | ||
Dorsomorphin | Merck | 171260-10MG | ||
Recombinant Mouse BMP-4 | R&D | 5020-BP-010 | ||
PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | ||
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | ||
Tween-20 | Promega | H5151 | ||
Duolink II Detection Reagents (Orange) | OLINK | 92007-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS | Olink Bioscience | 92004-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS | Olink Bioscience | 92002-0100 | ||
Duolink II Mounting Medium with DAPI | Olink Bioscience | 82040-0005 | ||
Duolink II Wash Buffers Fluorescence | Olink Bioscience | 82049 |