Analisando a função de GTPases Pequenas pela microinjeção de Plasmids em Polarized Células Epiteliais
Summary
Este artigo detalha os procedimentos envolvidos na análise da superexpressão e GTPases pequenas células epiteliais polarizadas utilizando a técnica de microinjeção.
Abstract
Células epiteliais polarizar sua membrana plasmática em bioquímica e funcionalmente distintos domínios apical e basolateral onde o domínio apical enfrenta o 'livre' e superfícies da membrana basolateral é em contato com o substrato e as células vizinhas. Ambos os domínios de membrana são separados por junções apertadas, que formam uma barreira de difusão. Apical-basolateral polarização pode ser reproduzido com sucesso na cultura quando as células epiteliais como Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), as células são semeados em altas densidades, em filtros de policarbonato e cultivados por vários dias 1 2. Estabelecimento e manutenção da polaridade celular é regulada por um conjunto de pequenas GTPases da superfamília Ras, como Rala, Cdc42, Rab8, Rab10 e Rab13 3 4 5 6 7. Como todas as GTPases ciclo dessas proteínas entre um estado PIB-bound inativos e um estado GTP-bound ativo. Mutações específicas nas regiões de ligação de nucleotídeos interferir com esta bicicleta 8. Por exemplo, Rab13T22N está permanentemente bloqueado no PIB forma e, assim, apelidado de "negativo dominante", enquanto Rab13Q67L já não pode hidrolisar GTP e é, portanto, trancado em um estado "ativo dominante" 7. Para analisar a sua função em células negativo dominante e dominante alelos ativos de GTPases são normalmente expressos em níveis elevados para interferir com a função das proteínas endógenas 9. Uma maneira elegante de alcançar altos níveis de superexpressão em um curto espaço de tempo é introduzir os plasmídeos que codificam as proteínas relevantes diretamente no núcleo das células cultivadas em polarizado filtro suporta o uso de técnica de microinjeção. Isso é muitas vezes combinada com a co-injeção de plasmídeos repórter que codificam os receptores da membrana plasmática que são especificamente classificadas para o domínio apical ou basolateral. A carga freqüentemente utilizado para analisar a carga de classificação para o domínio basolateral é um alelo sensível à temperatura da glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSVGts045) 10. Esta proteína não pode dobrar corretamente a 39 ° C e por isso serão retidos no retículo endoplasmático (ER), enquanto a proteína reguladora de interesse é montado no citosol. A mudança para a 31 ° C, então, permitir VSVGts045 dobrar corretamente, deixam o ER e viajar para a membrana plasmática 11. Esta perseguição é geralmente realizado na presença de cicloheximida para prevenir a síntese de proteína ainda mais levando a resultados mais limpo. Aqui nós descrevemos em detalhe o procedimento de microinjecting plasmídeos em células polarizadas e incubações subseqüentes, incluindo mudanças de temperatura que permitem uma análise global das proteínas reguladoras envolvidas na triagem basolateral.
Protocol
Discussion
Os passos mais críticos para um experimento de microinjeção de sucesso são a qualidade ea pureza do DNA e da polaridade de suas células. Sem células polarizadas, o seu controle de injeção já terá mistargeted VSVG eo experimento não pode ser usado. Se o DNA é de má qualidade, o DNA pode entupir a agulha de injeção levando a pouca ou nenhuma expressão da proteína desejada de todo. Além disso, é aconselhável a utilização de plasmídeos de expressão que são conhecidos por levar a níveis de alta expr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma concessão do National Institutes of Health (GM070736) para H. Fölsch. SF Ang foi apoiada por um * STAR A bolsa de Pós-Graduação e RS Kang foi apoiada pela Base Celular e Molecular do Programa de Treinamento de Doenças (GM8061)
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| Axiovert 200 Microscope with heated stage | Carl Zeiss Inc | Custom order |
| Injectman NI2 Femtojet micromanipulator | Eppendorf | Custom order |
| Femtotips II (Microinjection needles) | Eppendorf | 930000043 |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 |
| Clear 12-mm transwell filter supports | Corning Costar | 3460 |
| Endotoxin-free plasmid maxiprep kit | Sigma-Aldrich | NA0400 |
Referências
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