Medição precisa e simples do pró-inflamatórias IL-1β citocinas usando um ensaio Estimulação Sangue Total

Resumo

Nós descrevemos um imunoensaio simples para medir a produção de citocinas pró-inflamatórias, como IL-1 beta de produção, em pacientes com fenótipos Autoinflamatórias. Pela ativação de células em culturas de sangue total com patógeno-padrões moleculares associados, especificamente com lipopolissacarídeo, a secreção de citocinas podem ser convenientemente avaliados em sobrenadantes de sangue total.

Resumo

Processos inflamatórios resultantes da secreção de mediadores solúveis por células do sistema imunológico, levar a várias manifestações na pele, articulações e outros tecidos, bem como a homeostase das citocinas alterada. O sistema imune inato desempenha um papel crucial no reconhecimento de patógenos e outros estímulos endógenos perigo. Uma das principais citocinas liberado por células do sistema imunológico inato é Interleucina (IL) -1. Portanto, nós utilizamos um ensaio de estimulação todo sangue para medir a secreção de citocinas inflamatórias e especificamente da citocinas pró-inflamatórias IL-1β ^{1, 2, 3.}

Pacientes com disfunções genéticas do sistema imune inato causando síndromes Autoinflamatórias mostram uma liberação exagerada de IL 1β madura-upon estimulação com LPS sozinho. Para avaliar o componente imunológico inato de pacientes que apresentam patologias inflamatórias associadas, usamos um imunoensaio específico para detectar as respostas imunes celulares ao patógeno-padrões moleculares associados (PAMPs), tais como a endotoxina bacteriana gram-negativa, o lipopolissacarídeo (LPS ). Estes PAMPs são reconhecidos por receptores de reconhecimento de patógenos (PRRs), que são encontrados nas células do sistema imune inato ^{4, 5, 6, 7.} Um sinal primário, LPS, em conjunto com um sinal secundário, ATP, é necessária para a ativação do inflammasome, um complexo multiprotein que os processos pró-IL-1β à sua forma, maduro bioativos ^{4, 5, 6, 8, 9, 10.}

O ensaio de sangue total requer a manipulação de amostra mínima para avaliar a produção de citocinas, quando comparado a outros métodos que exigem o isolamento trabalho intensivo e cultura de populações de células específicas. Este método difere de outros ensaios de estimulação de sangue total, ao invés de diluir as amostras com uma proporção de RPMI mídia, realizamos uma contagem de células brancas do sangue diretamente do sangue total diluído e, portanto, estimular um número conhecido de células brancas do sangue na cultura ^2. Os resultados deste ensaio de sangue especial toda demonstrar uma nova técnica útil na elucidação coortes paciente apresentando fisiopatologias Autoinflamatórias.

Protocolo

1. Recolha de Sangue Total

1. Obter um mínimo de 10 mL de sangue periférico de indivíduos afectados, bem como idade e sexo pareados controles saudáveis. Sangue venoso deve ser coletado em heparina sódica tubos vacutainer de coleta de sangue, ao invés de usar outros anticoagulantes, como EDTA, e invertido várias vezes para garantir a mistura adequada com a heparina sódica. Note-se que 10 mL é o volume mínimo de sangue necessário para amostras de revestimento em duplicado para este ensaio particular.
2. As amostras devem ser processadas o mais rapidamente possível após a coleta para obter melhores resultados. No entanto, o sangue heparinizado pode ser ar....

Discussão

O ensaio de sangue total descrito é um método simples que reproduz com mais exatidão condições fisiológicas quando comparada a outras técnicas que exigem isolamento de células e processamento das amostras extensas e manipulação. Este método utiliza a Visão Cellometer com AO a contagem de células brancas do sangue em sangue total e, portanto, fornece uma maneira de padronizar as amostras com precisão com base em números de celular.

É de notar que, para este ensaio, o sangue total deve ser ela.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de coleta de sangue com heparina sódica	BD Biosciences	366480
Meio RPMI 1640	GIBCO, por Life Technologies	21870-100
Acridina laranja	Invitrogen	A3568
Cellometer Vision	Nexcelom Bioscience		Contate a empresa para obter informações sobre o instrumento
Câmara de contagem de células Cellometer	Nexcelom Bioscience	CHT4-SD100
Placa de cultura de tecidos com 24 poços	Corning	3524
LPS de E. coli K12 ultra puro	Invitrogen	tlrl-eklps
Sal hidratado de adenosina 5´-trifosfato dissódico	Sigma-Aldrich	A26209
Sistema Bio-plex 200	Bio-Rad		Contate a empresa para obter informações sobre o instrumento
Ensaio x-plex humano Bio-Plex Pro para citocinas	Bio-Rad		Os ensaios x-plex são produzidos sob medida de acordo com as citocinas de interesse especificadas