يقتصر المقايسات السمسة لقياس ردود الخلايا القاتلة الطبيعية lytic لفيروس نقص المناعة الخلايا المصابة بواسطة نقاء الخلايا المستهدفة. نظهر هنا عزلة سكان عالي النقاء من HIV – 1 المصابة الانفجارات تي خلية الأولية من خلال الاستفادة من القدرة HIV – 1 – s إلى أسفل تعدل CD4.
الطبيعية القاتلة (ناغورني كاراباخ) الخلايا هي عنصر حيوي للاستجابة المناعية الفطرية إلى الخلايا المصابة بالفيروسات. من المهم أن نفهم قدرة الخلايا القاتلة الطبيعية للاعتراف وليز HIV – 1 لتحديد الخلايا المصابة في وظيفة أي aberrancy الخلايا القاتلة الطبيعية ضد المصابين بفيروس الإيدز الخلايا يمكن ان تؤدي الى العلاجات التي من شأنها أن تعزز نشاطها لحل الخلايا. هناك حاجة لاستخدام بفيروس نقص المناعة البشرية الأولية تي خلية تفجيرات والخلايا المستهدفة بدلا ثم المصابة – T – خطوط خلية في المقايسات السمسة. تي خلية الخطوط ، حتى من دون إصابة ، معرضة جدا للتحلل الخلايا القاتلة الطبيعية. وعلاوة على ذلك ، فمن الضروري استخدام الخلايا الأولية ذاتي لمنع فئة كبيرة معقدة التوافق النسيجي أنا عدم التطابق بين الهدف والخلايا المستجيب من شأنها أن تؤدي في تحلل. فشلت الدراسات المبكرة تقييم الاستجابات الخلية لحل الخلايا القاتلة الطبيعية للخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية الأولية لإظهار قتل كبيرا من 1،2 الخلايا المصابة. ومع ذلك ، باستخدام HIV – 1 قد اصيبوا بالعدوى الأولية (خلايا تي) والخلايا المستهدفة في الخلايا القاتلة الطبيعية المقايسات الفنية صعب بسبب وجود تلوث الخلايا غير المصابة 3. سوف تتعارض هذه الخلية المصابة إلى نسبة الخلايا غير المصابة في نتيجة التباين في قتل الخلايا القاتلة الطبيعية بين العينات التي قد لا تكون نتيجة لتباين في وظيفة الخلية المانحة ناغورني كاراباخ. وبالتالي ، سيكون من المفيد للعمل مع السكان الخلية المصابة تنقيته من أجل توحيد نسب المستجيب لاستهداف الخلايا التجارب بين 3،4. نحن هنا لشرح عزلة سكان عالي النقاء من الخلايا المصابة HIV – 1 من خلال الاستفادة من القدرة HIV – 1 في أسفل تعدل CD4 على الخلايا المصابة وتوافر مجموعات تجارية لإزالة الخلايا الميتة أو التي تحتضر 3-6. ويمكن عندئذ المصابين الأولية المنقى تي خلية تفجيرات استخدامها كأهداف في تحبب إما السامة للخلايا أو مقايسة مع تنقية الخلايا القاتلة الطبيعية للسكان والمستجيب 5-7. استخدام الخلايا القاتلة الطبيعية كما المستجيبات في مقايسة تحبب بتقييم قدرة كوريا الشمالية على خلية للافراج عن محتويات lytic من 8 lysosomes المتخصصة تسمى "حبيبات لحل الخلايا". بواسطة تلطيخ مع الضد a مترافق ملون تألقي ضد CD107a ، وهو بروتين غشاء الليزوزومية أن يصبح أعربت على سطح الخلايا القاتلة الطبيعية عند حبيبات لحل الخلايا الصمامات إلى غشاء البلازما ، يمكن أن نحدد ما هي النسبة المئوية للخلايا NK degranulate ردا على استهداف الاعتراف الخلية. بدلا من ذلك ، يمكن تقييم نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية lytic في مقايسة السامة للخلايا التي تسمح لتحديد نسبة الخلايا المستهدفة من قبل lysed الافراج عن 51 ساعة معتمدة من داخل الخلية المستهدفة في وجود خلايا NK.
عندما يوظف بشكل صحيح يجب أن المقايسات الموصوفة في هذا البروتوكول تقديم صورة ممثل قدرة الخلايا القاتلة الطبيعية لdegranulate ضد وليز HIV – 1 الخلايا المصابة (انظر الشكل 5). وينبغي أن تحبب الخلايا القاتلة الطبيعية في التصدي للفيروس الخلايا المصابة والخلايا القاتلة الطبيعية تحلل الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية يكون متناسبا بشكل مباشر 10. نتائج موثوق بها لفحوصات two الخلية NK الوظيفية لقياس ردود السامة للخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية خلايا تعتمد على عزل عالي النقاء الخلايا القاتلة الطبيعية ، فضلا عن سكان عالي النقاء من الخلايا المصابة. طهارة والخلايا القاتلة الطبيعية HIV – 1. الخلايا المصابة هي حاسمة لتحقيق المستجيب دقيقة إلى حد ما لاستهداف نسبة الخلايا وبالمثل ، وإزالة الخلايا الميتة وأفكارك من السكان الخلية الهدف المهم قبل وضع العلامات الكروم 51 أو الحضانة مع الخلايا المستجيب (51). الكروم يمكن استيعابها من قبل الخلايا التي تشهد موت الخلايا المبرمج وجود الخلايا الميتة أو أفكارك خلال النظائر خطوة الوسم وسوف يؤدي إلى الإفراج عن عفوية عالية ، وسوف يشوه تحلل ٪ محسوبة محددة. وعلاوة على ذلك ، قد وجود الخلايا الميتة أو أفكارك الزناد NK تحبب الخلايا مما يؤدي إلى مستويات مرتفعة بشكل غير طبيعي التعبير CD107a. pipetting الدقيق ضروري عند إزالة supernatants خالية من الخلايا بعد حضانة الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا المستهدفة في المقايسات 51 الإفراج الكروم ، والاختلافات في حجم طاف إزالتها من كل تتكاثر بشكل جيد وسوف يؤدي إلى انحراف مستوى عال. ويمكن إجراء تعديلات على هذه البروتوكولات لتقييم دور مستقبلات محددة في ناغورني كاراباخ ادى تحلل الخلايا القاتلة الطبيعية من الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية التي يحتضنها والمستجيبات أو أهداف مسبقة للثقافة بالتعاون مع الأجسام المضادة لمستقبلات معينة معادية أو يغاندس 6،11. ويمكن استخدام المعالجة خلوى الخلايا القاتلة الطبيعية (على سبيل المثال ، IL – 2 ، IL – 15) لتقييم وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية حفزت 12. وبالمثل ، قد يتم تنفيذ المقايسات الضد السمسة تعتمد الخلية باستخدام هذه البروتوكولات. يمكن أن تضاف لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية الأضداد (على سبيل المثال ، ومكافحة gp120) إلى الخلايا المستهدفة للاعتراف الخلية المنخفض NK مستقبلات القطعة Fc تقارب 13 CD16. هذه المقايسات ، على الرغم من تشكيل لقياس استجابات الخلايا السامة للخلايا NK إلى الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية ، ويمكن أيضا أن يتم تعديل لقياس قدرة الخلايا القاتلة الطبيعية لإنتاج السيتوكينات التالية الاعتراف الخلية المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. على الرغم من أننا الموصوفة في هذا البروتوكول استخدام الخلايا في المختبر المصابة والخلايا المستهدفة وصفت لنا في الآونة الأخيرة جيل من الخلايا المستهدفة من المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. هذا يتطلب عزل خلايا CD4 + T – خلايا تليها توسيع الخلايا على مدى فترة أسبوعين بعد التحفيز مع mitogens في حضور انترلوكين 2 11. بعد فترة اسبوعين للتوسع ، يتم استخدام البروتوكولات المذكورة في هذه المقالة لعزل الخلايا المستهدفة.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Vaccutainer Tubes (Sodium Heparin) | Becton Dickenson | 367874 | ||
RosetteSep CD4+ T-cell Isolation Kit | StemCell Technologies | 15062 | ||
CMF PBS | Hyclone | SH30256.01 | ||
FBS | Hyclone | 10437-028 | ||
Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | ||
RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | ||
Penicillin / Streptomycin | Hyclone | SV30010 | ||
L-glutamine | Cellgro | 25-005-Cl | ||
T-cell Expansion Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-441 | ||
CMF HBSS (1x) | Hyclone | SH30588.01 | ||
0.5M EDTA | 46-034-Cl | |||
NK Cell Negative Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-657 | ||
IMDM | Gibco | 12440-046 | ||
CD4+ Positive Isolation Kit | Invitrogen | 113.31D | ||
Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | ||
Polybrene | Santa Cruz | sc-134220 | ||
CD3 PacificBlue | Becton Dickenson | 558117 | ||
CD14 PacificBlue | Biolegend | 325616 | ||
CD20 PacificBlue | Biolegend | 302328 | ||
CD56 APC | Biolegend | 318310 | ||
CD69 PE | Becton Dickenson | 555531 | ||
CD107a FITC | Becton Dickenson | 555800 | ||
51Chromium | Perkin Elmer | NEZ030002MC | ||
Gamma Counter Tubes | Perkin Elmer | 1270-401 | ||
2470 Automatic Gamma Counter | Perkin Elmer | 2470-0050 | ||
FACS Diva | Beckton Dickenson | 643629 | ||
FlowJo | TreeStar | FJ-9-1YR |