تحريض مستضد خيفي محددة استعطال الإنسان في خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى التي تحفيز مستضد خيفي مع حصار العلامة المشارك تنشيطية

Summary

توضح هذه الورقة تقنية بسيطة للحث على مستضد خيفي محددة استعطال في خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى. ويمكن تطبيق هذه التقنية لتوليد خلايا سريريا المانحة غير alloreactive. ويمكن ضخ هذه الخلايا المناعية وإعادة تحسين تقليل سمية خيفي بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم.

Abstract

خيفي زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (AHSCT) توفر أفضل فرصة للعلاج لكثير من المرضى المصابين بأمراض الدموية الخلقية والمكتسبة. للأسف ، لا يمكن زرع الخلايا التائية alloreactive المانحة التي تعترف وأضرار صحية نتيجة أنسجة المريض في الطعم ضد المضيف المرض (GvHD) ^1. واحد تحديا لAHSCT الناجح هو الوقاية من دون الإضرار GvHD يرتبط بها من الآثار المفيدة لخلايا تي المانحة ، ولا سيما إعادة المناعة والوقاية من الانتكاس. ويمكن منع GvHD من قبل المنظمات غير محددة استنفاد الخلايا التائية المانحة من ترقيع الخلايا الجذعية أو عن طريق إدارة المناعة الدوائية. للأسف هذه المقاربات زيادة العدوى والمرض الانتكاس ^2-4. استراتيجية بديلة هو انتقائي alloreactive تستنفد خلايا تي المانحة بعد allostimulation من قبل خلايا المتلقي تقديم المستضد (APC) قبل الزرع. تحسن التجارب السريرية في وقت مبكر من هذه الاستراتيجيات allodepletion إعادة المناعي بعد HLA – متطابقة HSCT دون GvHD الزائدة ^{5 ، 6.} ومع ذلك ، تتطلب بعض التقنيات المتخصصة allodepletion إنتاج المتلقي APC ⁶ و ⁷ و بعض النهج قد قبالة المستهدفة بما في ذلك آثار استنفاد الخلايا المانحة T الممرض محددة ⁽⁸⁾ وخلايا CD4 T التنظيمية ^9. نهج واحد هو تعطيل بديلة من الخلايا التائية alloreactive المانحة عبر تحريض مستضد خيفي hyporesponsiveness محددة. ويتحقق ذلك من خلال تحفيز الخلايا المانحة APC مع المتلقي في الوقت الذي توفر إشارات الحصار شارك في تنشيط CD28 بوساطة ¹⁰ ، وهذا "alloanergization" نهج alloreactivity يقلل بنسبة 1-2 سجلات مع الحفاظ على الممرض واستجابات المستضد T – ورم الخلايا المرتبطة بها في المختبر ¹¹ . كانت استراتيجية استخدمت بنجاح في 2 و 1 استكملت الدراسات التجريبية الجارية السريرية التي غرست في alloanergized الخلايا التائية المانحة خلال أو بعد HLA – متطابقة HSCT مما أدى إلى إعادة المناعي السريع ، والالتهابات الحادة وأقل القليل GvHD الحادة والمزمنة من المتلقين السيطرة التاريخية unmanipulated HLA – متطابقة زرع ^12. هنا نحن لدينا وصف بروتوكول للجيل الحالي من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMC) التي تم alloanergized لHLA – متطابقة PBMC منشط غير ذات صلة. ويتحقق بواسطة Alloanergization allostimulation في وجود الاجسام المضادة ليغاندس B7.1 وB7.1 لعرقلة CD28 بوساطة costimulation. هذا الأسلوب لا يتطلب إنتاج APC مشجعا المتخصصة وبسيطة لتنفيذ ، لا تتطلب سوى واحد وفيفو السابقين خطوة قصيرة نسبيا الحضانة. على هذا النحو ، يمكن أن يكون النهج الموحد بسهولة للاستخدام السريري لتوليد الخلايا التائية المانحة alloreactivity مع انخفاض ولكن مع الاحتفاظ الممرض حصانة محددة لنقل بالتبني في تحديد AHSCT لتحسين مناعة دون إعادة GvHD المفرطة.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. إعداد PBMC</p><ol><liيجب الالتزام> إجراءات تقنية العقيم جيدة والاحتياطات العالمية خلال لسلوك هذا البروتوكول.</li><li> عزل PBMC من المانحين المتطوعين الأصحاء بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة باستخدام Ficoll – Hypaque. بدلا من ذلك يمكن إحياء PBMC cryopreserved.</li><li> الكونت PBMC قابلة للحياة بعد تلطيخ مع الأزرق التريبان باستخدام عدادة الكريات. Resuspend PBMC ثقافة كاملة في وسائل الإعلام (CM) بتركيز 1 مليون خلايا قابلة للحياة / مل في أنبوب 15mL فالكون.</li></ol><p class="jove_title"> 2. إعداد Alloanergizing السائبة المشارك الثقافة</p><ol><liوهناك حاجة> PBMCs من اثنين من المانحين منفصلة لإعداد alloanergization الثقافات. والخلايا من إحدى الجهات المانحة بمثابة الرد وخلايا أخرى من الجهات المانحة سيكون بمثابة منبه (منشط يسمى الطرف الأول).</li><li> ضع 10000000 مشجعا PBMC بمبلغ 1 مليون / مل في أنبوب 15 مل فالكون وإضافة 100mg من B7.1 مكافحة 100mg و الأجسام المضادة B7.2 المضادة للكتلة costimulation. تستنهض الهمم بلطف الأنابيب واحتضان لمدة 30 دقيقة. شروط الحضانة لهذا وجميع الخطوات اللاحقة هي 37 درجة مئوية ثاني / 5 ٪₂ / الرطوبة 80 ٪</li><li> أشرق مشجعا PBMC (3.3 غراي) وإضافة إلى 50cm T – 25³ قارورة الثقافة الخلية مع غطاء الغاز قابلة للاختراق. التسمية القارورة "السائبة alloanergizing المشترك الثقافة".</li><li> إضافة 10ML PBMC من مستجيب (بمبلغ 1 مليون / مل في CM) إلى القارورة.</li><li> إضافة مزيد من 100mg كل من الأضداد B7.2 المضادة والمعادية للB7.1 المزيج بلطف وقبل وضع القارورة تستقيم في حاضنة لمدة 72 ساعة</li></ol><p class="jove_title"> 3. إعداد التحكم السائبة المشارك الثقافة</p><ol><li> ضع 10000000 مشجعا PBMC (بمبلغ 1 مليون / مل) في أنبوب 15mL فالكون.</li><li> أشرق 10000000 مشجعا PBMC (3.3 غراي). وإضافة إلى 50cm³ قارورة ثقافة الخلية. التسمية "السائبة تحكم المشترك الثقافة".</li><li> إضافة 10ML PBMC من مستجيب في 1 مل / مليون لCM في القارورة ومزيج بلطف قبل وضعها في دورق تستقيم في حاضنة لمدة 72 ساعة.</li></ol><p class="jove_title"> 4. إعداد الرد الابتدائية المختلطة اللمفاويات (عالم حواء) ​​لقياس مدى فعالية التعاون تنشيطية الحصار</p><ol><li> ويتم قياس فعالية من الحصار costimulatory في عالم حواء الأولية التي تم إعدادها باستخدام PBMC من alloanergizing السائبة والسيطرة المشتركة الثقافات</li><liيتم تعيين> عالم حواء والابتدائي حتى في اليوم نفسه الذي تم تعيين معظم الثقافات تصل</li><li> التسمية الأولى القاع one U 96 كذلك لوحة "عالم حواء الابتدائية" عن كل نقطة من النقاط الزمنية الثلاث التي تقاس (يوم 4 و 5 و 6 بعد أن يتم تعيين لوحات متابعة).</li><li> 5mL صب من كل من التحكم alloanergizing السائبة وشارك في الثقافات في أنابيب 15mL فالكون.</li><li> 200mL الماصة للتعليق خلية من كل أنبوب فالكون في الآبار ثلاث نسخ عن كل لوحة. تسمية هذه الآبار "لا الحصار costimulatory (CSB)" للخلايا من سيطرة معظم الثقافات وشارك في "ديوان الخدمة المدنية" للخلايا من الجزء الأكبر alloanergizing المشترك الثقافات</li><li> إضافة 200mL سم إلى 6 آبار في كل لوحة التحكم والسلبية. يضاف 200mL PBS لجميع الآبار الفارغة للحد من التبخر. لوحات مكان في الحاضنة.</li></ol><p class="jove_title"> 5. إقامة عالم حواء الثانوية لقياس مدى فعالية Alloanergization</p><ol><li> 72 ساعة بعد إعداد الجزء الأكبر شارك في الثقافات ، ويتم قياس alloresponses المتبقية في PBMCs alloanergized في عالم حواء الثانوية. في PBMC الثانوية ، عالم حواء من كل من الجزء الأكبر alloanergizing الثقافة المشتركة والسيطرة الأكبر شارك في الثقافة وغسلها وrestimulated مع PBMC allostimulator المشع</li><li> لإعداد التسمية عالم حواء الثانوية القاع one U 96 كذلك لوحة "عالم حواء الثانوية" عن كل نقطة من النقاط الزمنية الثلاث التي تقاس (يوم 3 و 5 و 7 بعد إعداد).</li><li> إزالة 5mL من كل من التحكم alloanergizing السائبة وشارك في الثقافات ، ونقل إلى أنابيب الطرد المركزي وفالكون 15mL لمدة 5-10 دقائق على 2000 rpm.Aspirate وطاف بعناية ، وعرقلة بيليه ، إضافة 10ML سم وأجهزة الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى. كرر هذه الخطوة الغسيل.</li><li> Resuspend الخلايا في 1mL سم. عد خلايا قابلة للحياة باستخدام التريبان تلطيخ الأزرق ، وضبط تركيز الخلية إلى 1 مليون خلية المستجيب قابلة للحياة / مليلتر.</li><li> 100ML الماصة للتعليق خلية من كل أنبوب فالكون في الآبار ثلاث نسخ من كل لوحة. تسمية هذه الآبار "الطرف الأول (اف ب) allorestimulation"</li><li> 100ML الماصة للتعليق خلية من كل أنبوب فالكون الى 3 آبار أخرى في كل لوحة وتسمية هذه الآبار "CD3/28 التحفيز"</li><li> لتحضير الخلايا مشجعا للعالم حواء الثانوية ، وعزل PBMC من الدم الطازج (أو إحياء PBMC cryopreserved) من المانحين صحية نفسها المستخدمة لتزويد first PBMCs مشجعا الحزب في alloanergizing والثقافات السيطرة.</li><li> تعليق PBMC من الجهة المانحة FP بتركيز 1 مل / مليون وأشرق (3.3Gy)</li><li> إضافة 100ML منشط لخلايا المشع إلى الآبار المسمى "allorestimulation FP"</li><li> لعناصر إيجابية ، إضافة 1 مل من كل من CD3 والأجسام المضادة وحيدة النسيلة وCD28 98mL من CM إلى الآبار المسماة "التحفيز CD3/28". إضافة 200 مل من CM إلى 6 آبار في كل لوحة كعنصر تحكم السلبية و200mL من برنامج تلفزيوني لبئر فارغة. وضع لوحات في الحاضنة.</li></ol><p class="jove_title"> 6. قياس خصوصية Alloanergization</p><ol><li> يتم تحديد خصوصية alloanergization بمقارنة تكاثر الخلايا المأخوذة من مستجيب alloanergizing الانتهاء والسيطرة المشتركة بعد التحفيز مع الثقافات PBMC المشع تم الحصول عليها من "طرف ثالث" متبرع سليم (أي جهة مانحة مختلفة للطرف الأول) في الثانوية عالم حواء.</li><li> three تسمية 96 لوحات جيدة "الثانوية خصوصية عالم حواء" يوم 3 و 5 و 7.</li><li> إزالة 5mL من كل من التحكم alloanergizing السائبة وشارك في نقل الثقافات والأنابيب وأجهزة الطرد المركزي 15mL فالكون لمدة 5-10 دقائق على 2000 دورة في الدقيقة. وطاف نضح بعناية ، تعطيل بيليه ، إضافة 10ML سم وأجهزة الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى. كرر هذه الخطوة الغسيل.</li><li> Resuspend الخلايا في 1mL سم. العد باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق ، وضبط تركيز الخلية إلى 1 مليون خلية المستجيب قابلة للحياة / مليلتر.</li><li> لتحضير الخلايا third الطرف مشجعا للعالم حواء الثانوية ، وعزل PBMC من الدم الطازج (أو إحياء PBMC cryopreserved) من المانحين صحية جديدة. 100ML ماصة للتعليق خلية من كل أنبوب فالكون في الآبار ثلاث نسخ من كل لوحة. تسمية هذه الآبار "TP allostimulation"</li><li> تعليق PBMC من متبرع TP في 1 مل / مليون وأشرق (3.3 غراي)</li><li> إضافة 200mL المشع من الخلايا مشجعا TP إلى الآبار المسماة "allostimulation TP"</li><liويمكن أيضا> وخصوصية alloanergization يتحدد بمقارنة تكاثر الخلايا المأخوذة من مستجيب alloanergizing الانتهاء والسيطرة المشتركة الثقافات بعد التحفيز مع الممرض المعدية مثل CMV. لهذه الخطوة لا بد من استخدام الرد PBMC من الجهات المانحة مع ردود التكاثري أثبتت سابقا lysate CMV.</li><li> three تسمية 96 لوحات جيدة "الثانوية عالم حواء CMV" يوم 3 و 5 و 7.</li><li> لتحضير الخلايا المستجيب لعالم حواء الثانوية لقياس ردود CMV ، ونقل 5 مل من كل من التحكم alloanergizing السائبة وشارك في الثقافات لأنابيب 15 مل ، ويغسل ، عد وresuspend بمبلغ 1 مليون خلية / مل في CM كما هو موضح سابقا . 100ML الماصة للتعليق خلية من كل أنبوب فالكون الى 3 آبار في كل لوحة.</li><li> إضافة 0.1 مل من lysate CMV في 100ul CM إلى الآبار</li><li> إضافة 200 مل من CM إلى 6 آبار في كل لوحة كعنصر تحكم السلبية وإضافة إلى برنامج تلفزيوني 200mL من آبار فارغة. وضع لوحات في الحاضنة.</li></ol><p class="jove_title"> 7. قياس انتشار طراز MLRs في الابتدائي والثانوي</p><ol><liيقاس> تكاثر الخلايا المستجيب بواسطة مقايسة التأسيس ثيميدين في طراز MLRs الابتدائية والثانوية. يقاس الانتشار في يوم 4 و 5 و 6 بعد أن يتم تعيين لوحات عالم حواء الابتدائية وحتى في يوم 3 و 5 و 7 بعد لوحات عالم حواء الثانوية تم إعدادها.</li><liيضاف> 1mCi من ثيميدين معالج بالتريتيوم إلى 16 ساعة قبل الحصاد الآبار</li><li> بعد اضافة ثيميدين معالج بالتريتيوم ، هو المحتضنة لوحة لساعات ثم تحصد further16 على حصيرة مرشح باستخدام حصادة Tomtec (أو ما شابه). الهواء الجاف filtermat لمدة ساعة ثم وضع في كيس من العينة ، وإضافة 5 مل التلألؤ السائل والختم. قراءة اللوحة في التلألؤ Wallac بيتا مايكرو لمكافحة أو ما شابه ذلك.</li></ol><p class="jove_title"> 8. حساب الفعالية المشتركة في حصار تنشيطية في عالم حواء الابتدائية</p><ol><liويتم احتساب> وتثبيط مئوية (PI) من alloresponses الأولية إلى 100 X [يعني حرف في الدقيقة في الآبار allostimulation (السائبة alloanergy شارك في الثقافة PBMC) — يعني حرف في الدقيقة في الآبار allostimulation (السائبة تحكم المشترك الثقافة PBMC)}<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq1.jpg" alt="Equation 1" ></ol><p class="jove_title"> 9. حساب فعالية Alloanergization في عالم حواء الثانوية</p><p class="jove_content"> يحسب PI من alloresponses الثانوي<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq2.jpg" alt="Equation 2" ><p class="jove_title"> 10. حساب خصوصية Alloanergization في عالم حواء الثانوية</p><ol><li> بعد restimulation من الخلايا مع CD3 وCD28 ، يمكن أيضا allostimulators TP أو CMV مستضد ، وPI الاستجابات لهذه المحفزات أن تحسب باستخدام هذه الصيغة. وهذا يعطي قدرا من خصوصية عملية alloanergization</li></ol><p class="jove_title"> 11. توليد Alloanergized PBMC المانحة للاستخدام السريري بعد خيفي زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCT)</p><ol><liقد تكون ولدت> PBMC Alloanergized المانحة للاستخدام السريري بعد HLA – متطابقة HSCT خيفي باستخدام بروتوكول المبينة أعلاه</li><li> عندما توليد خلايا للاستخدام السريري ، ويتم الحصول على الرد من الجهة المانحة PBMC HSCT PBMC ومشجعا من قبل المتلقي HSCT الزرع.</li><li> عندما يولد PBMC للاستخدام السريري ، يتم تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف جيدة عملية التصنيع في مرافق معتمدة الجذعية تجهيز الخلية.</li><liتجرى> مراقبة الجودة بما في ذلك فحوصات إضافية فحوصات الذيفان الداخلي وصمة عار غرام والثقافة لتلبية معايير السلامة قبل الافراج عن الخلايا للاستعمال السريري</li></ol><p class="jove_title"> 12. ممثل النتائج</p><p class="jove_content"> استخدام HLA – متطابقة مشجعا PBMC والمستجيب ، ووجود الحصار costimulatory في عالم حواء الأولية يقلل من PBMC alloproliferation يعني الرد في يوم 5 إلى حوالي 30 ٪ (+ / — 10 ٪ ، يعني + / — الانحراف المعياري) من أن ينظر في مراقبة عالم حواء الابتدائية في غياب costimulatory الحصار. هذه هي معادلة لتثبيط متوسط ​​alloproliferation الابتدائية حوالي 70 ٪ (+ / — 10 ٪) في D5 ،<strong> الشكل 1 ألف وباء</strong>.</p><p class="jove_content"> في عالم حواء الثانوية في يوم 5 ، FP alloproliferation من PBMC alloanergized عادة 10-15 ٪ (+ / — 10 ٪) من ذلك شهدت تعادل مع PBMC السيطرة على تثبيط يعني انتشار 85-90 ٪ (+ / — 10 ٪) ،<strong> الشكل 2A وباء</strong>. هذا يدل على أن يتم PBMC alloanergized hyporesponsive allostimulators لتنظيم الأسرة.</p><p class="jove_content"> وفي المقابل PBMC alloanergized تحتفظ عادة 7-10 ٪ من انتشارها لmitogens (CD3/CD28 الأضداد) ، وallostimulators TP CMV lysate (CMV في التفاعل الجهات المانحة). هذا يدل على أن من hyporesponsiveness PBMC alloanergized غير محددة لalloantigens FP.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> الشكل 1. أ.</strong> انتشار (يحدده ثيميدين التأسيس) في رد الفعل الأولية المختلطة باستخدام الخلايا الليمفاوية HLA – متطابقة مشجعا والخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى المستجيب (PBMC) في غياب أو وجود الحصار costimulatory به وحيدة النسيلة المضادة للأنسنة وB7.2 – B7.1 الأجسام المضادة. وتظهر النتائج على النحو يعني (+ / – SD) ممثل للتجارب فريدة من نوعها 8 باستخدام منشط في الرد أزواج.<strong> B</strong>. النسبة المئوية لتثبيط alloproliferation في طراز MLRs الأولية التي أجريت في وجود الحصار costimulatory به وحيدة النسيلة المضادة للأنسنة B7.1 – B7.2 والأجسام المضادة. وتظهر النتائج على النحو يعني (+ / – SD) لنفس 8 ازواج في الرد مشجعا فريد يصور في الشكل 1A.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> الشكل 2. أ.</strong> انتشار (يحدده ثيميدين التأسيس) في طراز MLRs الثانوية حيث المستجيب PBMC من طراز MLRs الأولية التي أجريت في غياب (الرقابة PBMC) أو وجود الحصار costimulatory (PBMC alloanergized) هي restimulated المشع مع التحفيز والتشجيع الطرف الأول. وتظهر النتائج على النحو يعني (+ / – SD) لأزواج 8 مشجعا في الرد فريدة في الشكل 1.<strong> B</strong>. النسبة المئوية لتثبيط alloproliferation الطرف الأول في الثانوية حيث طراز MLRs المستجيب PBMC من طراز MLRs الأولية التي أجريت في غياب (الرقابة PBMC) أو وجود الحصار costimulatory (PBMC alloanergized) هي restimulated المشع مع التحفيز والتشجيع الطرف الأول. وتظهر النتائج على النحو يعني (+ / – SD) لأزواج 8 مشجعا في الرد فريدة في الشكل 1 والشكل 2A.</p>

Discussion

<p class="jove_content"> وتحريض مستضد خيفي hyporesponsiveness محددة ، أو استعطال في PBMC المانحة عبر allostimulation في حضور المشارك تنشيطية الحصار هو تقنية بسيطة لتوليد PBMC المانحة مع alloreactivity مخفضة. وقد وضعنا عملية في المختبر وتطبق حاليا استراتيجية في العيادة لتوليد PBMC المانحة مع alloreactivity مخفضة للالتسريب بعد HLA – متطابقة HSCT خيفي. الهدف من استخدام مثل هذا العلاج هو تحسين إعادة المناعي دون سمية الزائدة. على الرغم من محدودية التطبيق السريري الحالي لدينا استراتيجية لتحديد HSCT خيفي ، يمكن تطبيق النهج المتبع في أماكن أخرى ، حيث تسبب تلف الأنسجة غير المرغوب فيها عن طريق استجابات الخلايا التائية ، مثل رفض عمليات زرع الأعضاء الصلبة أو الظروف الذاتية.</p><p class="jove_content"ويمكن استخدام> الكواشف الحصار عن عدة إشارات شارك في تنشيطية CD28 بوساطة خلال عملية شاركت في الثقافة alloanergization. نحن هنا وصف حالتنا الراهنة باستخدام بروتوكول السريرية الصف أنسنة الاجسام المضادة الموجهة ضد الفئران يغاندس من CD28 (B7.1 وB7.2). غير السريرية الصف لمكافحة الفئران والإنسان B7.1 B7.2 الأضداد متاحة تجاريا من عدة مصنعين. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الانصهار البروتين اللمفاويات التائية السامة مستضد التوزيع (CTLA) 4 المناعي (IG) لعرقلة CD28 – costimulation أثناء عملية alloanergization. CTLA4 – الإيج ، الذي يتألف من خارج الخلية جزء من جزيء CTLA4 ترتبط مستقبلات غاما مفتش FC ، يتحد مع تقارب عالية لB7.1 وB7.2. استخدام CTLA4 – الإيج النتائج في فعالية مماثلة وخصوصية alloanergization من PBMCs الإنسان.</p><p class="jove_content"> إن أسلوب alloanergization بسيطة لتنفيذ. يمكن استخدامها طازجة أو cryopreserved سابقا PBMCs مشجعا مع عدم وجود اختلاف كبير في نتائج هذه العملية. شرط واحد فقط الخطوة السابقة حضانة قصيرة نسبيا مع عدم وجود خلايا الجسم الحي إجراءات الفرز تقلل من احتمال موت الخلايا والتلوث الجرثومي للخلايا قبل التسريب الذي يجعل استراتيجية بسيطة نسبيا لتطبيق على نطاق والسريرية.</p><p class="jove_content"> واحد الحد من هذا النهج وصفنا (ومناهج أخرى للحد من الخلايا بشكل انتقائي alloreactivity الإنسان) هو عدم وجود فحص في الوقت الحقيقي لتحديد alloreactivity المتبقية. المقايسات الانتشار تأخذ 3-5 أيام لإجراء لتأكيد خفض alloreactivity والخلايا المولدة للاستخدام السريري يجب غرست قبل نتائج هذه المقايسات يجري المتاحة. وعلاوة على ذلك ، وقياس انتشار PBMCs بواسطة ثيميدين التأسيس ، على الرغم من السهل القيام بها ، والتدابير انتشار خلايا B وخلايا فرعية أخرى بالإضافة إلى انتشار الخلايا التائية. يمكن استخدام صبغة CFSE التخفيف من مستجيب PBMCs باعتباره البديل مقايسة وتصاريح تحديد الخلايا التائية فرعية محددة alloproliferation. وإحدى الطرق لتحسين تطبيق نهج السريرية تكون استراتيجيتنا لتطوير والتحقق من صحة الفحص من alloreactivity يأخذ سوى بضع ساعات لإجراء التي يمكن أن يؤديها قبل الافراج عن الخلايا alloanergized للاستخدام السريري.</p><p class="jove_content"> بالإضافة إلى إظهار efficiacy الاستراتيجية من المهم أيضا لتأكيد عملية alloanergization التحديد. ويمكن بسهولة أن يتم ذلك عن طريق تحديد الحفاظ النسبي للalloresponses allostimulators محددة لطرف ثالث ، وعندما يجري alloanergized خلايا CMV المانحة التفاعل ، من خلال الحفاظ على ردود التكاثري لCMV</p>

Materials

Name of Reagent/Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ficoll-Hypaque PLUS	GE Life Sciences	17-1440-02
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine 200mM	Invitrogen	25030-081
Gentamicin	Invitrogen	15750-060
Human AB serum (heat inactivated)	Gemini Bio-Products	100-512	Use validated batches
Complete Culture Media (500ml)			440ml RPMI 1640, 50ml AB serum, 5ml Hepes, 5 ml Glutamine, 167uL Gentamicin
Irradiator	GammaCell 1000
T-25 Cell Culture Flasks with gas permeable caps	Corning, Inc.	3056
Humanized Monoclonal anti-B7.1 and anti B7.2 antibodies			See protocol text
U bottomed 96 well culture plates	BD Labware	353077
Monoclonal CD3 antibody	Beckman Coulter	IM0178	Reconstitute with 200ml distilled water
Monoclonal CD28 antibody	Beckman Coulter	IM1376	Reconstitute with 200ml distilled water
CMV grade 2 antigen	Microbix	EL-01-02
Tritiated Thymidine	NEN	NET027
Scintillation Fluid	PerkinElmer, Inc.	1205-440
Harvester	Tomtec
Printed Filtermat A	PerkinElmer, Inc.	1450-421
Filter Bag	PerkinElmer, Inc.	1450-432
1450 MicroBeta TriLux Scintillation Counter	Wallac