Мы демонстрируем иммунопреципитации хроматина (чип) метод идентификации факторных взаимодействий в тканях специфических генов во время или после наступления тканеспецифические экспрессии генов в тканях мышей в зачаточном состоянии. Этот протокол должен быть широко применяется для изучения тканеспецифические активации генов, как это происходит во время нормального эмбрионального развития.
Хроматин иммунопреципитации (чип) является мощным инструментом для определения белка: хроматина взаимодействий, которые происходят в контексте живых клеток 1-3. Эта техника была широко использована в клетках тканевой культуры, и в меньшей степени, в первичных тканей. Применение чипа грызунов эмбриональной ткани, особенно на ранних времен развития, осложняется ограниченным количеством ткани и гетерогенность клеточной и тканевой типы в зародыше. Здесь мы представляем метод для выполнения чипов с помощью эмбриональных диссоциированных день 8,5 (E8.5) эмбриона. Стриженый хроматина из одного E8.5 эмбриона можно разделить на срок до пяти аликвоты, которая позволяет следователю достаточно материала для элементов управления и для исследования специфического белка: хроматина взаимодействий.
Мы использовали эту технику, чтобы начать документа белка: хроматина взаимодействий в спецификации тканеспецифические программ экспрессии генов. Неоднородность типов клеток в эмбрионе обязательно ограничивает применение этого метода, поскольку в результате обнаружения белка: хроматина взаимодействия без выделения ли взаимодействия происходят во всех, подмножество, или одного типа клеток (ы). Тем не менее, исследование тканей определенных генов во время или после начала тканеспецифические экспрессии гена возможна по двум причинам. Во-первых, иммунопреципитации ткани специфические факторы обязательно изолирует хроматина от типа клеток, где фактор выражается. Во-вторых, иммунопреципитации коактиваторов и гистонов содержащие пост-трансляционной модификации, которые связаны с активацией генов должно быть найдено только на гены и регуляторные последовательности гена в клетке типа, где ген или были активированы. Техника должна быть применима к изучению наиболее тканеспецифические события активации генов.
В примере, описанном ниже, мы использовали E8.5 и эмбрионов мыши E9.5 для изучения связывания факторов в скелетных мышцах конкретного промотора гена. Сомитов, которые предшественник ткани, из которой скелетных мышц туловища и конечностей образуют, присутствуют на E8.5-9.5 4,5. Myogenin является регулирующим фактором, необходимых для скелетных мышц дифференциации 6-9. Данные показывают, что myogenin связан с собственным промоутером в E8.5 и E9.5 эмбрионов. Потому что myogenin выражается только в сомитов на данном этапе развития 6,10, данные показывают, что myogenin взаимодействия со своими промоутером уже имели место в скелетных мышцах клеток-предшественников в E8.5 эмбрионов.
В описанных ChIP протокол, мы покажем, что миогенной myogenin регулятор связан с myogenin промоутер в ткани скелетных мышц предшественником присутствует в одном E8.5 и E9.5 эмбрионов. До исследования широко характеризуется myogenin привязка к E коробке, содержащей последовательности, начиная с начально…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана NIH R01 GM56244 в Ани, который включает в себя средства награждены через оздоровлении американской экономики и реинвестировании 2009 года, а по НИЗ R01 GM87130 к Jarp
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
ChIP Assay Kit | Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore | 17-295 | ||
Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS | |
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | Gibco Labs, Invitrogen | 12100-061 | High glucose content | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco Labs, Invitrogen | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free | |
Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | ||
Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit | |
Penicillin/streptomycin stock solution | Gibco Labs, Invitrogen | 5000 μg/ml concentration | ||
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | ||
Salmon sperm DNA /Protein A agarose | Millipore | 16-157 | ||
myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | ||
Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | ||
Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | ||
GoTaq Q-PCR master mix | Promega | A6001 |