אנו מדגימים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) שיטה לזהות אינטראקציות גורם ספציפי על רקמות גנים במהלך או לאחר הופעת ביטוי גנים ברקמות ספציפיות ברקמות עובריים בעכבר. פרוטוקול זה צריך להיות רלוונטי נרחב לחקר ההפעלה רקמות ספציפיות גן כפי שהיא מתרחשת במהלך ההתפתחות העוברית נורמלי.
הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות חלבונים: אינטראקציות הכרומטין המתרחשים בהקשר של תאים חיים 1-3. טכניקה זו נוצלה נרחב תאים בתרבית רקמה, ובמידה פחותה ברקמות העיקרי. היישום של שבב לרקמות מכרסם עובריים, במיוחד בזמנים המוקדמים של הפיתוח, הוא מסובך ידי כמות מוגבלת של רקמות ואת ההטרוגניות של התא סוגי רקמות בעובר. כאן אנו מציגים שיטה לבצע באמצעות שבב ביום עובריים ניתק 8.5 (E8.5) העובר. הכרומטין גזוז מעובר אחד E8.5 ניתן לחלק עד חמישה aliquots, המאפשר החוקר חומר מספיק בקרות לחקירה של חלבון מסוים: אינטראקציות הכרומטין.
יש לנו שימוש בטכניקה זו כדי להתחיל לתעד חלבון: אינטראקציות הכרומטין במהלך המפרט של רקמות ספציפיות תוכניות ביטוי גנים. ההטרוגניות של סוגי תאים בעובר בהכרח מגביל את היישום של טכניקה זו, כי התוצאה היא גילוי של חלבון: אינטראקציות הכרומטין בלי להבחין אם האינטראקציות מתרחשות כל, קבוצת משנה של, או סוג תא בודד (ים). עם זאת, בדיקה של רקמות ספציפיות גנים במהלך או לאחר תחילת ביטוי גנים ברקמות ספציפיות אינו ריאלי משתי סיבות. ראשית, immunoprecipitation גורמים רקמות ספציפיות בהכרח מבודד הכרומטין מסוג התא שבו הגורם המתבטא. שנית, immunoprecipitation של coactivators ו ההיסטונים המכיל שלאחר translational שהשינויים הקשורים להפעלת הגן צריך רק למצוא את הגנים רצפים רגולטוריים הגן בסוג התא שבו הגן הוא להיות או הופעל. הטכניקה צריכה להיות ישימה המחקר של רוב רקמות ספציפיות הפעלת גן אירועים.
בדוגמה להלן, השתמשנו E8.5 E9.5 ואת עוברי עכבר לבחון גורם מחייב את מקדם שרירי השלד גן ספציפי. Somites, שהן רקמות מבשר שממנו שרירי השלד של המטען והגפיים יהוו, נוכחים E8.5 9.5-4.5. Myogenin הוא גורם הרגולציה הנדרשים בידול שרירי השלד 6-9. הנתונים מראים כי myogenin קשורה האמרגן משלה E8.5 E9.5 ועוברים. מכיוון myogenin מתבטאת רק somites בשלב זה של התפתחות 6,10, הנתונים מצביעים על כך myogenin אינטראקציות עם האמרגן שלה התרחשו כבר מבשר לתאי שריר השלד ב E8.5 עוברים.
בפרוטוקול CHIP שתואר, אנו מראים כי myogenin הרגולטור myogenic קשורה האמרגן myogenin ברקמת שריר השלד מבשר נוכח E8.5 E9.5 יחיד עוברים. מחקרים קודמים מאופיין בהרחבה myogenin מחייב תיבת דואר המכיל רצפים, החל הראשונית בניסויים במבחנה ג'ל משמרת שימוש ב-DNA במבחנה מתורגם או מיוצר bacteriall…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM56244 אל ANI, הכולל קרנות הוענק דרך השחזור אמריקאי reinvestment חוק של 2009, ועל ידי NIH R01 GM87130 כדי JARP
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
ChIP Assay Kit | Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore | 17-295 | ||
Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS | |
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | Gibco Labs, Invitrogen | 12100-061 | High glucose content | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco Labs, Invitrogen | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free | |
Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | ||
Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit | |
Penicillin/streptomycin stock solution | Gibco Labs, Invitrogen | 5000 μg/ml concentration | ||
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | ||
Salmon sperm DNA /Protein A agarose | Millipore | 16-157 | ||
myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | ||
Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | ||
Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | ||
GoTaq Q-PCR master mix | Promega | A6001 |