Nós demonstramos uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) para identificar as interações fator em tecido-específicos genes durante ou após o início da tecido-específicos de expressão gênica em camundongos tecido embrionário. Este protocolo deve ser amplamente aplicáveis para o estudo do tecido-específicos ativação do gene como ocorre durante o desenvolvimento embrionário normal.
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Artigo de método
Ensaio para imunoprecipitação da cromatina Genes Tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
Cromatina imunoprecipitação (chip) é uma ferramenta poderosa para identificar proteínas: interações cromatina que ocorrem no contexto de células vivas 1-3. Esta técnica tem sido amplamente explorada em células de cultura de tecidos, e, em menor grau, no tecido primário. A aplicação do chip para o tecido embrionário de roedores, sobretudo em momentos iniciais de desenvolvimento, é complicado pela quantidade limitada de tecido e da heterogeneidade das células e tecidos no embrião. Aqui apresentamos um método para realizar chip usando um dia dissociada embrionárias 8.5 (E8.5) do embrião. Cromatina tosquiada de um embrião E8.5 única pode ser dividido em até cinco alíquotas, que permite que o investigador material suficiente para controles e para a investigação de proteínas específicas: interações cromatina.
Temos utilizado esta técnica para começar a documentar proteína: interações cromatina durante a especificação de tecido programas específicos de expressão gênica. A heterogeneidade de tipos de células em um embrião, necessariamente, restringe a aplicação desta técnica porque o resultado é a detecção de proteínas: interações cromatina sem distinguir se as interações ocorrem em todos, um subconjunto de, ou um único tipo de células (s). No entanto, o exame de tecido específico genes durante ou após o aparecimento de tecido-específicos de expressão gênica é viável por dois motivos. Primeiro, imunoprecipitação de fatores tecido específico necessariamente isola cromatina do tipo de célula onde o fator é expresso. Segundo, imunoprecipitação de coativadores e histonas contendo modificações pós-translacionais que estão associados com a ativação do gene só deve ser encontrada em genes e seqüências regulatórias no tipo de células onde o gene está sendo ou foi ativado. A técnica deve ser aplicado ao estudo da maioria dos tecidos específicos eventos de ativação do gene.
No exemplo descrito abaixo, utilizamos E8.5 e E9.5 embriões de camundongos para analisar fator determinante em um esqueleto promotor do gene do músculo específico. Somitos, que são os tecidos precursor a partir do qual os músculos esqueléticos do tronco e membros formarão, estão presentes em E8.5-9.5 4,5. Miogenina é um fator de regulação necessários para a diferenciação do músculo esquelético 6-9. Os dados demonstram que miogenina está associado ao seu próprio promotor em E8.5 e E9.5 embriões. Porque miogenina é expresso apenas em somitos nesta fase de desenvolvimento 6,10, os dados indicam que as interações com miogenina seu promotor própria já ocorreu em células do músculo esquelético precursor em E8.5 embriões.
Protocolo
1. Isolamento de embriões
Nota: Todas as operações envolvendo ratos deve ser realizada de acordo com o cuidado de animais e políticas adequadas de uso e protocolos
- Verificar a presença de um plugue de acasalamento em camundongos fêmeas da manhã depois do acasalamento e as fêmeas separadas dos machos acasalaram parafuso, colocando-os em uma gaiola diferente. Meio-dia do dia que a ficha de acasalamento se observa é considerado o dia embrionárias 0,5 (E0.5) do desenvolvimento.
- Em E8.5, (ou o estágio desejado, se for diferente), o sacrifício do mouse usando um protocolo aprovado.
- Molhar a barrig....
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Discussão
No protocolo ChIP descrito, mostramos que a miogenina regulador miogênico está associada com o promotor miogenina no tecido músculo esquelético precursor presente em E8.5 E9.5 única e embriões. Estudos anteriores extensamente caracterizada miogenina ligação a caixa de E contendo seqüências, começando com a inicial em experimentos in vitro, utilizando gel shift in vitro traduzido ou bactérias produzidas DNA miogenina e radiolabeled codificação a parte relevante de seqüências-alvo gene regulador.......
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Divulgações
Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade de Massachusetts Medical School IACUC.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 GM56244 a ANI, que inclui fundos concedidos através da Lei de Recuperação e Reinvestimento de 2009, e pelo NIH R01 GM87130 para JARP
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de Ensaio ChIP | Upstate, Millipore | 17-295 | |
| Colagenase Tipo II | Invitrogen | 17101015 | Diluição com PBS 1 x |
| Dulbecco’meio de Eagle modificado (DMEM) | GIBCO, da Life Technologies | 12100-061 | Alto teor de glicose |
| Dulbecco’s fosfato tamponado salino 1X (DPBS) | GIBCO, da Life Technologies | 14190-144 | Livre de cloreto de cálcio, livre de cloreto de magnésio |
| Soro bovino fetal (SBF) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Kit de extração de gel | QIAquick | 28704 | kit de 50 reações |
| Solução estoque de penicilina/estreptomicina | GIBCO, da Life Technologies | 5000 μconcentração em g/ml | |
| Coquetel de Inibidores de Protease | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| DNA de esperma de salmão/agarose Protein A | EMD Millipore | 16-157 | |
| anticorpo anti-miogenina | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | |
| IgG de coelho normal | EMD Millipore | 12-370 | |
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
| GoTaq Q-PCR master mix | Promega Corp. | A6001 |
Referências
- Minard, M. E., Jain, A. K., Barton, M. C. Analysis of epigenetic alterations to chromatin during development. Genesis. 47, 559-572 (2009).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DN....
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Reimpressões e permissões
