Kromatin Immunoprecipitation analys för Tissue-specifika gener med början av karriären musembryon
Summary
Vi visar en kromatin immunoprecipitation (chip) för att identifiera faktorer interaktioner vid vävnads-specifika gener under eller efter debuten av vävnadsspecifika genuttryck i möss embryonal vävnad. Detta protokoll skall vara allmänt tillämpliga för studiet av vävnad-specifika genen aktivering som inträffar under normala fosterutvecklingen.
Abstract
Kromatin immunoprecipitation (chip) är ett kraftfullt verktyg för att identifiera proteiner: kromatin samspel som sker i samband med levande celler 1-3. Denna teknik har i stor utsträckning utnyttjats i celler vävnadskultur, och i mindre utsträckning, i obearbetad vävnad. Tillämpningen av chip till gnagare embryonal vävnad, särskilt i äldre tid av utveckling, kompliceras av den begränsade mängden vävnader och heterogena celler och typer vävnad i embryot. Här presenterar vi en metod för att utföra ChIP med en dissocierade embryonala dag 8,5 (E8.5) embryo. Klippt kromatin från en enda E8.5 embryo kan delas in i upp till fem alikvoter, vilket gör att utredaren tillräckligt material för kontroller och för utredning av specifika proteiner: kromatin interaktioner.
Vi har använt denna teknik för att börja dokumentera protein: kromatin interaktioner under specifikationen av vävnad-specifika program genuttryck. Den heterogenitet celltyper i ett embryo begränsar nödvändigtvis tillämpningen av denna teknik eftersom resultatet är identifieringen av proteiner: kromatin interaktioner utan att urskilja om interaktioner förekommer i alla, en delmängd av, eller en enda celltyp (s). Det är dock undersökning av vävnad-specifika gener under eller efter uppkomsten av vävnad-specifika genuttryck möjligt av två skäl. Först isolerar immunoprecipitation av vävnad specifika faktorer nödvändigtvis kromatin från cellen typ där faktorn uttrycks. För det andra bör immunoprecipitation av coactivators och histoner som innehåller post-translationella modifieringar som är förknippade med genaktivering bara finns på gener och reglerande sekvenser i den celltyp där genen är eller har aktiverats. Tekniken bör tillämpas på studiet av de flesta vävnads-specifika händelser genen aktivering.
I exemplet som beskrivs nedan används vi E8.5 och E9.5 embryon musen för att undersöka faktor bindande på en skelettmuskel specifika genen. Somites, som är en föregångare vävnader från vilken skelettet musklerna i bålen och lemmar kommer att utgöra, är närvarande vid E8.5-9,5 4,5. Myogenin är en reglerande faktor som krävs för skelettmuskulaturen differentiering 6-9. Uppgifterna visar att myogenin är förknippade med den egna medel i E8.5 och E9.5 embryon. Eftersom myogenin enbart uttrycks i somites i detta skede av utvecklingen 6,10, den data indikerar att myogenin interaktioner med sin egen promotor redan har inträffat i skelettmuskulaturen muskelceller föregångare i E8.5 embryon.
Protocol
Discussion
I den beskrivna ChIP protokollet visar vi att myogenic regulatorn myogenin förknippas med myogenin promotorn i skelettmuskel föregångare vävnad som finns i samma E8.5 och E9.5 embryon. Innan studier har i stor utsträckning präglats myogenin bindning till E låda som innehåller sekvenser, med början den inledande in vitro-gel skift försök att använda in vitro översättas eller bacterially produceras myogenin och radioaktivt märkt DNA som kodar för relevanta delar av regelverket mål gensek…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH R01 GM56244 till Ani, som inkluderar medel beviljas via amerikanska Återvinning och Reinvestment Act från 2009, och genom NIH R01 GM87130 till JARP
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ChIP Assay Kit | Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore | 17-295 | ||
| Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS | |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | Gibco Labs, Invitrogen | 12100-061 | High glucose content | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco Labs, Invitrogen | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | ||
| Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit | |
| Penicillin/streptomycin stock solution | Gibco Labs, Invitrogen | 5000 μg/ml concentration | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | ||
| Salmon sperm DNA /Protein A agarose | Millipore | 16-157 | ||
| myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | ||
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | ||
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | ||
| GoTaq Q-PCR master mix | Promega | A6001 |
Referências
- Minard, M. E., Jain, A. K., Barton, M. C. Analysis of epigenetic alterations to chromatin during development. Genesis. 47, 559-572 (2009).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19, 425-433 (1999).
- Johnson, K. D., Bresnick, E. H. Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, 27-36 (2002).
- Yusuf, F., Brand-Saberi, B. The eventful somite: patterning, fate determination and cell division in the somite. Anat Embryol (Berl). 211, 21-30 (2006).
- Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S., Montarras, D., Rocancourt, D., Relaix, F. The formation of skeletal muscle: from somite to limb. J Anat. 202, 59-68 (2003).
- Wright, W. E., Sassoon, D. A., Lin, V. K. Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MyoD. Cell. 56, 607-617 (1989).
- Edmondson, D. G., Olson, E. N. A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program. Genes Dev. 3, 628-640 (1989).
- Nabeshima, Y., Hanaoka, K., Hayasaka, M., Esumi, E., Li, S., Nonaka, I. Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect. Nature. 364, 532-535 (1993).
- Hasty, P., Bradley, A., Morris, J. H., Edmondson, D. G., Venuti, J. M., Olson, E. N., Klein, W. H. Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature. 364, 501-506 (1993).
- Sassoon, D., Lyons, G., Wright, W. E., Lin, V., Lassar, A., Weintraub, H., Buckingham, M. Expression of two myogenic regulatory factors myogenin and MyoD1 during mouse embryogenesis. Nature. 341, 303-307 (1989).
- Brennan, T. J., Olson, E. N. Myogenin resides in the nucleus and acquires high affinity for a conserved enhancer element on heterodimerization. Genes Dev. 4, 582-595 (1990).
- Rosenthal, N., Berglund, E. B., Wentworth, B. M., Donoghue, M., Winter, B., Bober, E., Braun, T., Arnold, H. H. A highly conserved enhancer downstream of the human MLC1/3 locus is a target for multiple myogenic determination factors. Nucleic Acids Res. 18, 6239-6246 (1990).
- Braun, T., Gearing, K., Wright, W. E., Arnold, H. H. Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer. Eur J Biochem. 198, 187-193 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T., Olson, E. Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding. J Biol Chem. 266, 2878-2882 (1991).
- French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter. Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).
- Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).
- Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo. Cell. 66, 305-315 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding. Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).
- Cserjesi, P., Olson, E. N. Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products. Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).
- Braun, T., Arnold, H. H. The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties. Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).
- Serna, d. e. l. a., L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex. Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).
- Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. An initial blueprint for myogenic differentiation. Genes Dev. 19, 553-569 (2005).
- Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters. EMBO J. 25, 502-511 (2006).
- Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis. J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).
- Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle. Dev Biol. 311, 650-664 (2007).
- Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter. Cell. 115, 751-763 (2003).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
