Vi visar en kromatin immunoprecipitation (chip) för att identifiera faktorer interaktioner vid vävnads-specifika gener under eller efter debuten av vävnadsspecifika genuttryck i möss embryonal vävnad. Detta protokoll skall vara allmänt tillämpliga för studiet av vävnad-specifika genen aktivering som inträffar under normala fosterutvecklingen.
Kromatin immunoprecipitation (chip) är ett kraftfullt verktyg för att identifiera proteiner: kromatin samspel som sker i samband med levande celler 1-3. Denna teknik har i stor utsträckning utnyttjats i celler vävnadskultur, och i mindre utsträckning, i obearbetad vävnad. Tillämpningen av chip till gnagare embryonal vävnad, särskilt i äldre tid av utveckling, kompliceras av den begränsade mängden vävnader och heterogena celler och typer vävnad i embryot. Här presenterar vi en metod för att utföra ChIP med en dissocierade embryonala dag 8,5 (E8.5) embryo. Klippt kromatin från en enda E8.5 embryo kan delas in i upp till fem alikvoter, vilket gör att utredaren tillräckligt material för kontroller och för utredning av specifika proteiner: kromatin interaktioner.
Vi har använt denna teknik för att börja dokumentera protein: kromatin interaktioner under specifikationen av vävnad-specifika program genuttryck. Den heterogenitet celltyper i ett embryo begränsar nödvändigtvis tillämpningen av denna teknik eftersom resultatet är identifieringen av proteiner: kromatin interaktioner utan att urskilja om interaktioner förekommer i alla, en delmängd av, eller en enda celltyp (s). Det är dock undersökning av vävnad-specifika gener under eller efter uppkomsten av vävnad-specifika genuttryck möjligt av två skäl. Först isolerar immunoprecipitation av vävnad specifika faktorer nödvändigtvis kromatin från cellen typ där faktorn uttrycks. För det andra bör immunoprecipitation av coactivators och histoner som innehåller post-translationella modifieringar som är förknippade med genaktivering bara finns på gener och reglerande sekvenser i den celltyp där genen är eller har aktiverats. Tekniken bör tillämpas på studiet av de flesta vävnads-specifika händelser genen aktivering.
I exemplet som beskrivs nedan används vi E8.5 och E9.5 embryon musen för att undersöka faktor bindande på en skelettmuskel specifika genen. Somites, som är en föregångare vävnader från vilken skelettet musklerna i bålen och lemmar kommer att utgöra, är närvarande vid E8.5-9,5 4,5. Myogenin är en reglerande faktor som krävs för skelettmuskulaturen differentiering 6-9. Uppgifterna visar att myogenin är förknippade med den egna medel i E8.5 och E9.5 embryon. Eftersom myogenin enbart uttrycks i somites i detta skede av utvecklingen 6,10, den data indikerar att myogenin interaktioner med sin egen promotor redan har inträffat i skelettmuskulaturen muskelceller föregångare i E8.5 embryon.
I den beskrivna ChIP protokollet visar vi att myogenic regulatorn myogenin förknippas med myogenin promotorn i skelettmuskel föregångare vävnad som finns i samma E8.5 och E9.5 embryon. Innan studier har i stor utsträckning präglats myogenin bindning till E låda som innehåller sekvenser, med början den inledande in vitro-gel skift försök att använda in vitro översättas eller bacterially produceras myogenin och radioaktivt märkt DNA som kodar för relevanta delar av regelverket mål gensek…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH R01 GM56244 till Ani, som inkluderar medel beviljas via amerikanska Återvinning och Reinvestment Act från 2009, och genom NIH R01 GM87130 till JARP
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
ChIP Assay Kit | Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore | 17-295 | ||
Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS | |
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | Gibco Labs, Invitrogen | 12100-061 | High glucose content | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco Labs, Invitrogen | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free | |
Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | ||
Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit | |
Penicillin/streptomycin stock solution | Gibco Labs, Invitrogen | 5000 μg/ml concentration | ||
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | ||
Salmon sperm DNA /Protein A agarose | Millipore | 16-157 | ||
myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | ||
Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | ||
Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | ||
GoTaq Q-PCR master mix | Promega | A6001 |