एक बीटा glucuronidase (गस) के आधार पर सेल मौत परख
Summary
क्रमादेशित कोशिका मृत्यु assays आमतौर पर डीएनए laddering या TUNEL के assays, जैसे स्तनधारी प्रणालियों में इस्तेमाल किया अक्सर पौधों में पुन: पेश करने के लिए मुश्किल है. एक गस संवाददाता प्रणाली के साथ संयोजन में, हम एक तेजी से, संयंत्र आधारित क्षणिक विशिष्ट जीन की संभावित मौत गुण का विश्लेषण परख का प्रस्ताव.
Abstract
हम एक उपन्यास क्षणिक संयंत्र अभिव्यक्ति प्रणाली है कि एक साथ रिपोर्टर जीन, β glucuronidase (गस), कोशिका मृत्यु के ख्यात सकारात्मक या नकारात्मक नियामकों के साथ व्यक्त विकसित किया है. इस प्रणाली में एन, benthamiana पत्ते हैं एक 35S संचालित अभिव्यक्ति विश्लेषण किया जा जीन युक्त कैसेट के साथ सह – घुसपैठ, और एक वाहन के रूप में गस वेक्टर pCAMBIA 2301 Agrobacterium तनाव LBA4404 का उपयोग. क्योंकि जीवित कोशिकाओं के लिए गस अभिव्यक्ति होती आवश्यक हैं, गस गतिविधि के नुकसान जब इस मार्कर जीन कोशिका मृत्यु का सकारात्मक नियामकों के साथ सह व्यक्त की उम्मीद है. समान रूप से, गस गतिविधि में वृद्धि हुई है मनाया जब विरोधी apoptotic जीन वेक्टर नियंत्रण की तुलना में उपयोग किया जाता है. जैसा कि नीचे दिखाया गया है, हम सफलतापूर्वक हमारे प्रयोगशाला में इस प्रणाली के इस्तेमाल के लिए दोनों के समर्थक और विरोधी मौत के खिलाड़ियों का विश्लेषण. ये विरोधी apoptotic संयंत्र परिवार बीसीएल-2 एसोसिएटेड athanoGene (बैग), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, जैसे BAX कोशिका मृत्यु के स्तनधारी inducers जाना जाता है, शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, हम इस प्रणाली का इस्तेमाल किया विशिष्ट truncations के प्रोटीन के भीतर मृत्यु समारोह है, जो संभव बाद translational / इन प्रोटीनों के संशोधन सक्रियण पर सुराग प्रदान कर सकता का विश्लेषण. यहाँ, हम विशिष्ट जीन की मौत समारोह की जांच में एक प्रारंभिक कदम के रूप में एक तेजी से और संवेदनशील संयंत्र आधारित पद्धति प्रस्तुत करते हैं.
Protocol
Discussion
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Rifampicin | VWR | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
| 4′-hydroxy-3′,5′-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
| 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| Bacto-tryptone | Fisher | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Bacto-yeast extract | VWR | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium chloride | VWR | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| N-Lauroylsarcosine | VWR | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
| 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
| Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
| β-Methylumbelliferone (MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
| Sodium carbonate | VWR | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |
Referências
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