A β غلوكورونيداز (GUS) موت الخلية استنادا الفحص
Summary
موت الخلايا المبرمج المقايسات التي يشيع استخدامها في نظم الثدييات مثل الحمض النووي أو المقايسات laddering النفق ، وغالبا ما يصعب استنساخها في النباتات. في توليفة مع نظام مراسل GUS ، نقترح السريع ، ومحطة عابرة مقايسة يستند إلى تحليل خصائص الموت المحتملة للجينات معينة.
Abstract
وقد طورنا رواية التعبير محطة عابرة في وقت واحد يعبر عن نظام الجين المراسل ، β غلوكورونيداز (GUS) ، مع المنظمين المفترضين الإيجابية أو السلبية لموت الخلية. في هذا النظام ، N. ويترك benthamiana المشترك تسللت مع الكاسيت التي تحتوي على التعبير مدفوعة 35S الجين لتحليلها ، وناقلات GUS pCAMBIA 2301 باستخدام الأجرعية LBA4404 سلالة كوسيلة. لأن هناك حاجة الخلايا الحية للتعبير GUS تحدث ، ومن المتوقع فقدان النشاط GUS عند هذا الجين علامة المشترك مع المنظمين وأعرب الإيجابية للموت الخلية. على قدم المساواة ، وزيادة النشاط GUS لوحظ عند استخدام الجينات المضادة للأفكارك مقارنة مكافحة النواقل. كما هو مبين أدناه ، وقد استخدمنا هذا النظام بنجاح في المختبر لتحليل كل من اللاعبين المؤيدة والمناهضة للموت. وتشمل هذه المحطة لمكافحة أفكارك بي سي إل 2 المرتبطين athanoGene (BAG) عائلة ، فضلا عن المعروف محرضات الثدييات من موت الخلايا ، مثل BAX. بالإضافة إلى ذلك ، فقد استخدمنا هذا النظام لتحليل وظيفة فاة truncations محددة داخل البروتينات ، التي يمكن أن تقدم أدلة على تعديل محتمل في مرحلة ما بعد متعدية / تفعيل هذه البروتينات. هنا ، نقدم طريقة سريعة والنباتات الحساسة القائمة ، كخطوة أولية في التحقيق في وفاة وظيفة للجينات معينة.
Protocol
Discussion
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Rifampicin | VWR | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
| 4′-hydroxy-3′,5′-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
| 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| Bacto-tryptone | Fisher | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Bacto-yeast extract | VWR | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium chloride | VWR | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| N-Lauroylsarcosine | VWR | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
| 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
| Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
| β-Methylumbelliferone (MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
| Sodium carbonate | VWR | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |
Referências
- Jefferson, R. A. GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).
- Nishihara, M. Expression of the β-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment. Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).
- Hodal, L. . Plant Science. 87, 115-115 (1992).
- Kabbage, M. The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators. Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).
- Kang, C. H. AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants. Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).
- Yan, J. . Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).
- Takayama, S., Reed, J. C. Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins. Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).
- Takayama, S. Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity. Cell. 80 (2), 279-279 (1995).
- Vitha, S. Quantitative β-glucuronidase assay in transgenic plants. Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).
- Otha, S. Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence. Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).
