Eine β-Glucuronidase (GUS) Basierend Cell Death Assay
Summary
Der programmierte Zelltod-Assays häufig in Säugetier-Systemen wie DNA laddering oder TUNEL-Assays, sind oft nur schwer in Pflanzen zu reproduzieren. In Kombination mit einem GUS-Reporter-Systems, schlagen wir eine schnelle, auf pflanzlicher Basis transienten Assay, um das Potenzial der Tod Eigenschaften bestimmter Gene zu analysieren.
Abstract
Wir haben eine neue vorübergehende Anlage Ausdruck System, das gleichzeitig Ausdruck der Reportergen β-Glucuronidase (GUS), mit vermeintlichen positive oder negative Regulatoren des Zelltods entwickelt. In diesem System, N. benthamiana Blätter sind mit einer 35S angetrieben Expressionskassette enthält das Gen analysiert werden co-infiltriert, und die GUS-Vektor pCAMBIA 2301 unter Verwendung von Agrobacterium LBA4404 als Vehikel. Da lebende Zellen benötigt werden für die GUS-Expression auftritt, ist der Verlust der GUS-Aktivität zu erwarten, wenn dieses Markergen wird mit positiven Regulatoren des Zelltods co-exprimiert. Ebenso erhöhte GUS-Aktivität beobachtet wird, wenn anti-apoptotischen Gene im Vergleich zu den Vektor-Steuerung verwendet werden. Wie unten gezeigt, haben wir erfolgreich dieses System in unserem Labor verwendet, um sowohl pro-und anti-death-Spieler zu analysieren. Dazu gehören die Anlage anti-apoptotischen Bcl-2 assoziierte athanoGene (BAG) Familie, sowie bekannte Säugetier-Induktoren von Zelltod, wie BAX. Darüber hinaus haben wir dieses System verwendet, um den Tod in Abhängigkeit von bestimmten Verkürzungen innerhalb Proteinen, die Hinweise auf die mögliche posttranslationale Modifikation / Aktivierung dieser Proteine könnte zu analysieren. Hier präsentieren wir eine schnelle und empfindliche Pflanzen basierende Methode, als einen ersten Schritt bei der Untersuchung des Todes Funktion bestimmter Gene.
Protocol
Discussion
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Rifampicin | VWR | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
| 4′-hydroxy-3′,5′-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
| 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| Bacto-tryptone | Fisher | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Bacto-yeast extract | VWR | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium chloride | VWR | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| N-Lauroylsarcosine | VWR | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
| 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
| Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
| β-Methylumbelliferone (MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
| Sodium carbonate | VWR | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |
Referências
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