ampliPHOX איתור Colorimetric על ה-DNA microarray לשפעת
Summary
ampliPHOX טכנולוגיית זיהוי colorimetric מוצג כחלופה זולה גילוי הקרינה עבור microarrays. בהתבסס על photopolymerization, ampliPHOX מייצר נקודות פולימר מוצק לעין עירומה רק כמה דקות. תוצאות הם צילמו אז לפרש באופן אוטומטי עם חבילת תוכנה פשוטה אך רבת עוצמה.
Abstract
Microarrays DNA התפתחו כמו כלי רב עוצמה לצורך זיהוי הפתוגן. 1-5 למשל, דוגמאות רבות של היכולת סוג נגיף שפעת תת הוכחו. 6-11 זיהוי subtyping של שפעת על microarrays DNA יש יישומים הן לציבור בריאות המרפאה לגילוי מוקדם, התערבות מהירה, למזער את ההשפעה של מגיפת שפעת. הקרינה מסורתית כיום זיהוי הנפוץ ביותר שיטת microarray. עם זאת, ככל שהטכנולוגיה מתקדמת לקראת microarray לשימוש קליני, 1 להחליף מכשור יקר עם טכנולוגיית זיהוי עלות נמוכה מפגין תכונות ביצועים דומים הקרינה יעשה מבחני microarray אטרקטיבי יותר וחסכונית.
הטכנולוגיה colorimetric ampliPHOX זיהוי מיועד יישומי מחקר, יש מגבלה של גילוי בתוך סדר גודל אחד של הקרינה המסורתית 11, עם יתרון העיקרי להיות העלות המשוערת של פי עשרה כלי נמוך בהשוואה סורקים microarray confocal נדרש הקרינה microarray זיהוי. יתרון נוסף הוא הקומפקטיות של המכשיר אשר מאפשר ניידות וגמישות, בניגוד מכשירים פלואורסצנטי המסורתית. בגלל הטכנולוגיה פילמור הוא לא ליניארי מטבעם כמו גילוי הקרינה, לעומת זאת, היא המתאימה ביותר עבור יישומים צפיפות נמוכה microarray שבו כן / לא לענות על נוכחות של רצף מסוים הוא הרצוי, כגון מערכי זיהוי הפתוגן. כיום הצפיפות במקום מקסימלית תואם זיהוי ampliPHOX הוא ~ 1800 נקודות / מערך. בגלל המגבלות צפיפות נקודה, microarrays צפיפות גבוהה יותר אינם מתאימים לאיתור ampliPHOX.
כאן, אנו מציגים טכנולוגיה ampliPHOX זיהוי colorimetric כשיטה הגברה אות על microarray צפיפות נמוכה פיתחה לגילוי ואפיון של נגיפי שפעת (FluChip). אף על פי פרוטוקול זה משתמש FluChip (microarray DNA) כיישום אחד ספציפי של ampliPHOX איתור, כל microarray שילוב היעד biotinylated ניתן שכותרתו זוהה באופן דומה. העיצוב microarray ו biotinylation יעד להישבות הם באחריות המשתמש. ברגע היעד biotinylated כבר שנתפסו על המערך, איתור ampliPHOX יכול להתבצע על ידי תיוג הראשון עם מערך המצומד streptavidin-תווית (ampliTAG). לאחר חשיפה לאור באמצעות Reader ampliPHOX, מכשיר פילמור של פתרון מונומר (ampliPHY) מתרחשת רק אזורים המכילים ampliTAG שכותרתו מטרות. הפולימר שנוצר יכול להיות מוכתם לאחר מכן עם פתרון רעיל כדי לשפר בניגוד חזותי, ואחריו הדמיה וניתוח באמצעות חבילת תוכנה פשוטה (ampliVIEW). Assay FluChip כולו ממדגם בלתי חילוץ לתוצאות יכול להתבצע על 6 שעות, הפעולות הגילוי ampliPHOX שתוארו לעיל ניתן להשלים כ -30 דקות.
Protocol
Discussion
הטכנולוגיה colorimetric ampliPHOX זיהוי המוצגת כאן היא אלטרנטיבה מהירה, זולה זיהוי צבע פלואורסצנטי יחיד עבור יישומים microarray צפיפות נמוכה. מוצג באופן סכמטי באיור 1, עיקרון הזיהוי מבוסס על שימוש של תווית photoinitiator (1B). בנוכחות פתרון מונומר המכילים (1C), חשיפה לאור גורמת photoiniti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
InDevR מודה NIH / NIAID U01AI070276 ו R43AI077112 למימון עבודה זו.
Materials
| Reagent/equipment | Manufacturer | Catalog # | Comments |
|---|---|---|---|
| Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
| ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
| 2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip primer mix | InDevR | N/A | not yet available for sale |
| Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
Referências
- Kumar, R. M. The Widely Used Diagnostics “DNA-Microarray”-A Review. Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).
- Miller, M. B., Tang, Y. W. Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology. Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).
- Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. DNA microarrays in the clinic: infectious diseases. BioEssays. 30, 673-682 (2008).
- Call, D. R. Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays. Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).
- Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. What does the future hold for clinical microbiology. Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).
- Dawson, E. D., Rowlen, K. L., Wang, Q., Tao, Y. J. MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A. Influenza: Molecular Virology. , (2010).
- Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray. J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).
- Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray. J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).
- Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. Identifying influenza viruses with resequencing arrays. Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).
- Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses. J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).
- Kuck, L. R., Taylor, A. W. Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays. Biotechniques. 45, 179-186 (2008).
- Avens, H. J., Bowman, C. N. Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays. Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).
- Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. Antigen detection using polymerization-based amplification. Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).
