ampliPHOX rilevazione colorimetrica su un DNA microarray per l'influenza
Summary
ampliPHOX tecnologia di rilevamento colorimetrico viene presentato come un'alternativa economica a fluorescenza per microarray. Sulla base di fotopolimerizzazione, ampliPHOX produce spot polimero solido visibile ad occhio nudo in pochi minuti. I risultati sono poi ripreso e interpretato automaticamente con un pacchetto software semplice ma potente.
Abstract
DNA microarray sono emerse come un potente strumento per la rilevazione di agenti patogeni. 1-5 Per esempio, molti esempi della capacità di tipo e sottotipo di virus influenzale sono stati dimostrati. 6-11 L'identificazione e la tipizzazione di influenza sul DNA microarray ha applicazioni sia in pubblico salute e la clinica per la diagnosi precoce, l'intervento rapido, e riducendo al minimo l'impatto di una pandemia influenzale. Fluorescenza tradizionale è attualmente il più utilizzato metodo di rilevamento microarray. Tuttavia, come la tecnologia dei microarray progredisce verso l'uso clinico, 1 sostituzione di strumentazione costosa tecnologia di rilevamento a basso costo che presentano caratteristiche di prestazioni simili a fluorescenza renderà saggi microarray più attraente e conveniente.
La rilevazione ampliPHOX colorimetrico di tecnologia destinata ad applicazioni di ricerca, ed ha un limite di rilevazione all'interno di un ordine di grandezza dei tradizionali fluorescenza 11, con un vantaggio principale è un approssimativo costo dieci volte inferiore rispetto a strumento del microarray scanner confocale necessari per fluorescenza microarray rilevamento. Un altro vantaggio è la compattezza dello strumento che consente la portabilità e flessibilità, a differenza dei tradizionali strumenti di fluorescenza. Perché la tecnologia di polimerizzazione non è così intrinsecamente lineare come rivelazione a fluorescenza, tuttavia, è più adatto per le applicazioni di densità più bassa microarray, in cui è desiderato un sì / no risposta per la presenza di una certa sequenza, come per gli array di rilevazione degli agenti patogeni. Attualmente la densità del punto massimo compatibile con la rilevazione ampliPHOX è ~ 1800 punti / array. A causa delle limitazioni densità posto, microarrays ad alta densità non sono adatti per il rilevamento ampliPHOX.
Qui, vi presentiamo la tecnologia di rilevamento colorimetrico ampliPHOX come metodo di amplificazione del segnale su un microarray a bassa densità sviluppato per la rilevazione e la caratterizzazione dei virus influenzali (FluChip). Anche se questo protocollo utilizza il FluChip (un DNA microarray) come una specifica applicazione di ampliPHOX rilevazione, ogni microarray incorporando obiettivo biotinilato possono essere etichettati e rilevati in modo analogo. Il design microarray e biotinilazione del bersaglio da catturare sono sotto la responsabilità dell'utente. Una volta che il bersaglio biotinilato è stato catturato sulla matrice, il rilevamento ampliPHOX può essere eseguito da tagging primo array con un coniugato streptavidina-label (ampliTAG). Su esposizione alla luce di usare lo strumento ampliPHOX Reader, polimerizzazione di una soluzione di monomero (ampliPHY) si verifica solo nelle regioni contenenti ampliTAG marcato obiettivi. Il polimero formato può essere successivamente colorato con un non-tossico soluzione per migliorare il contrasto visivo, seguita da immagini e analisi utilizzando un semplice pacchetto di software (ampliVIEW). Il test FluChip intero da un-estratto campione risultato può essere eseguita in circa 6 ore, e le fasi di rilevamento ampliPHOX descritto sopra può essere completata in circa 30 min.
Protocol
Discussion
La rilevazione ampliPHOX colorimetrico tecnologia qui presentata è una rapida, alternativa economica alla rilevazione unico colore a fluorescenza per applicazioni a bassa densità microarray. Mostrato schematicamente nella Figura 1, il principio di rilevazione si basa sull'utilizzo di una etichetta fotoiniziatore (1B). In presenza di un monomero contenente soluzione (1C), l'esposizione alla luce fa sì che il fotoiniziatore (ampliTAG) per innescare una reazione di polimerizzazione solo nelle re…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
InDevR riconosce NIH / NIAID U01AI070276 e R43AI077112 per il finanziamento di tale opera.
Materials
| Reagent/equipment | Manufacturer | Catalog # | Comments |
|---|---|---|---|
| Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
| ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
| 2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip primer mix | InDevR | N/A | not yet available for sale |
| Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
Referências
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