인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색
Summary
ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 microarrays에 대한 형광 검출하는 저렴한 대안으로 제공됩니다. photopolymerization에 따라 ampliPHOX 단지 몇 분 이내에 육안으로 보이는 고체 고분자 명소를 생산하고 있습니다. 결과는 간단하면서도 강력한 소프트웨어 패키지로 다음 몇 군데 자동으로 해석됩니다.
Abstract
의 DNA microarrays은 병원균 검출을위한 강력한 도구로 부상했습니다. 예를 들어 1-5를 입력하고, subtype의 독감 바이러스에 대한 능력의 많은 사례가 증명하고 있습니다.의 DNA microarrays에 독감의 6-11 식별 및 subtyping은 모두 공개 응용 프로그램을 가지고 건강과 조기 발견, 신속한 개입, 그리고 인플루엔자 유행의 영향을 최소화를위한 병원. 전통적인 형광 현재 가장 일반적으로 사용되는 microarray 검색 방법입니다. microarray 기술은 임상 사용을 향해 진행 그러나, 1 저비용 탐지 기술은 형광과 비슷한 성능 특성을 전시와 함께 고가의 장비를 대체하는 것은 microarray assays 더 매력적이고 비용 효율적인 것입니다.
ampliPHOX colorimetric 탐지 기술 연구 애플 리케이션을위한, 그리고 형광 microarray에 필요한 공촛점 microarray 스캐너에 비해 대략 10 배로 낮은 악기 비용중인 주요 장점과 함께, 전통적인 형광 11 크기 중 하나를 순서 내에서 감지 한계를 가지고있다 감지. 또 다른 장점은 기존의 형광 악기와는 달리, 이동성과 유연성 수있는 악기의 컴팩트 사이즈입니다. 중합 기술 형광 감지만큼 본질적으로 선형되지 않기 때문에, 그러나, 그것은 최고의 같은 병원체 검출 배열에 관해서는 특정 순서의 존재에 대한 예 / 아니오 대답이 원하는되는 낮은 밀도 microarray 어플 리케이션에 적합합니다. 현재 ampliPHOX 감지와 호환 최대 현장 밀도 ~ 1800 장소 / 배열입니다. 때문에 현장 밀도 제한의 높은 밀도 microarrays은 ampliPHOX 감지에 적합하지 않습니다.
여기, 우리는 인플루엔자 바이러스의 검출 및 특성 (FluChip)에 대한 개발 저밀도 microarray에 신호 증폭의 방법으로 ampliPHOX colorimetric 탐지 기술을 제시한다. 이 프로토콜은 ampliPHOX 감지, 비슷한 방식으로 표시하고 감지할 수 biotinylated 목표를 통합하는 microarray 중 하나가 특정 응용 프로그램으로 FluChip을 (DNA microarray)를 사용하지만. 캡쳐하는 대상의 microarray 디자인과 biotinylation은 사용자의 책임입니다. biotinylated 대상이 배열에 캡처되면 ampliPHOX 감지가 먼저 태그에 의해 streptavidin – 라벨 공액 (ampliTAG)로 배열을 수행할 수 있습니다. 단량체 솔루션의 ampliPHOX 리더 악기, 중합을 사용하여 빛의 노출시 (ampliPHY) ampliTAG – 표시 대상을 포함하는 지역에서만 발생합니다. 형성된 고분자는 연속적 간단한 소프트웨어 패키지 (ampliVIEW)을 사용하여 이미징 및 분석 다음 영상 대비를 향상시킬 수있는 무독성 솔루션을 물들일 수 있습니다. 결과 해제 추출 샘플에서 전체 FluChip 분석은 약 6 시간 수행할 수 있으며, 위에서 설명한 ampliPHOX 탐지 단계는 약 30 분 안에 완료할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
여기에 제시 ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 낮은 밀도 microarray 애플 리케이션을위한 단일 색상 형광 검출에 대한 신속하고 저렴한 대안입니다. 그림 1에 간략하게 구조와 같이 검출 원리는 photoinitiator 라벨 (1B)의 사용에 따라 달라집니다. 단량체 함유 용액 (1C)의 존재에 빛이 노출 photoinitiator (ampliTAG)가에만 표시 지역의 중합 반응 (1D) 실행하도록합니다. 인플루엔자 식별 및 subtyping?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
InDevR이 작품을 자금에 대한 NIH / NIAID U01AI070276 및 R43AI077112을 인정합니다.
Materials
| Reagent/equipment | Manufacturer | Catalog # | Comments |
|---|---|---|---|
| Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
| ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
| 2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip primer mix | InDevR | N/A | not yet available for sale |
| Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
Referências
- Kumar, R. M. The Widely Used Diagnostics “DNA-Microarray”-A Review. Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).
- Miller, M. B., Tang, Y. W. Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology. Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).
- Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. DNA microarrays in the clinic: infectious diseases. BioEssays. 30, 673-682 (2008).
- Call, D. R. Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays. Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).
- Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. What does the future hold for clinical microbiology. Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).
- Dawson, E. D., Rowlen, K. L., Wang, Q., Tao, Y. J. MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A. Influenza: Molecular Virology. , (2010).
- Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray. J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).
- Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray. J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).
- Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. Identifying influenza viruses with resequencing arrays. Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).
- Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses. J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).
- Kuck, L. R., Taylor, A. W. Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays. Biotechniques. 45, 179-186 (2008).
- Avens, H. J., Bowman, C. N. Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays. Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).
- Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. Antigen detection using polymerization-based amplification. Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).
