Fotoblekning tester (FRAP & Flip) för att mäta Chromatin Protein Dynamics i Living embryonala stamceller
Summary
Vi beskriver fotoblekning metoder inklusive fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) och fluorescens Förlust i fotoblekning (Flip) för att övervaka kromatin protein dynamik i embryonala stamceller (ES-celler). Kromatin protein dynamik, vilket anses vara ett av sätten att studera kromatin plasticitet, är förstärkt i pluripotenta celler.
Abstract
Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) och fluorescens Förlust i fotoblekning (Flip) gör det möjligt att studera proteiner dynamik i levande celler med god rumslig och tidsmässig upplösning. Här beskriver vi hur du utför FRAP och FLIP analyser av kromatin proteiner, inklusive H1 och HP1 i möss embryonala stamceller (ES-celler). I en FRAP experiment celler transfekterade, antingen tillfälligt eller stabilt, med ett protein av intresse smält med grönt fluorescerande protein (GFP) eller derivat därav (YFP, GFP, Cherry, etc.). I transfekterade, fluorescerande celler, blekmedel ett intensivt fokuserad laserstråle en relativt liten region av intresse (ROI). Lasern våglängd väljs enligt den fluorescerande protein som används för fusion. Laserljuset oåterkalleligen bleker den fluorescerande signal molekyler i ROI, och omedelbart efter blekning, återhämtning av fluorescerande signalen i blekt området – medierad av utbyte av blekt molekyler med oblekt molekyler – övervakas med hjälp av bildbehandling tid förfaller. Den genererade fluorescens återhämtning kurvor ger information om proteinets rörlighet. Om den fluorescerande molekyler är orörliga, kommer ingen fluorescens återhämtning observeras. I en kompletterande strategi, Fluorescens Förlust i fotoblekning (Flip), blekmedel laserstrålen på samma ställe upprepade gånger och signalen intensitet mäts på andra håll i fluorescerande celler. FLIP experiment mäter alltså signalen förfall snarare än fluorescens återhämtning och är användbara för att bestämma protein rörlighet samt protein skytteltrafik mellan cellulära utrymmen. Övergående bindning är en gemensam egendom för kromatin-associerade proteiner. Även om större del av varje kromatin protein är bundet till kromatin i varje ögonblick vid steady state är bindande övergående och mest kromatin proteiner har en hög omsättning på kromatin, med en uppehållstid i storleksordningen sekunder. Dessa egenskaper är avgörande för att generera hög plasticitet i genomet uttryck 1. Fotoblekning experiment är därför särskilt lämpligt att bestämma kromatin plasticitet med hjälp av GFP-fusion versioner av kromatin strukturella proteiner, särskilt i ES-celler, där den dynamiska utbyte av kromatin proteiner (inklusive heterochromatin protein 1 (HP1), länkare histon H1 och histoner kärna) är högre än i differentierade celler 2,3.
Protocol
Discussion
Skillnad från de flesta tillgängliga teknik, som innebär renade kromatin från cellpopulationer eller fasta celler, FRAP experiment följa förändringar i kromatin protein dynamik i levande celler. Vi fann kromatin protein dynamik att vara en god indikator för kromatin plasticitet. Men eftersom det kräver fixeringen genen av intresse med GFP kan tillägg av fluorescerande taggen störa proteinets funktion. Således, innan du fortsätter med FRAP måste fusionsproteinet vara rigoröst testade för att se till att d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmar i Meshorer labbet, särskilt Shai Melcer, Adi Alajem, Edupuganti Raghu Ram, Badi Sri Sailaja, Anna Mattout och Alva Biran, för kritiska synpunkter och för felsökning fotoblekning experiment på en daglig basis. EM är ett Joseph H. och Belle R. Braun Universitetslektor i biovetenskap och stöds av Israels Science Foundation (ISF 943/09), Israel hälsoministeriet (6007) Europeiska unionen (IRG-206.872 och 238.176), Israel Cancer Research Foundation, den inre applikativ Medical ger av det hebreiska universitetet och Israel psykobiologiska aspekter institutet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| DMEM | Sigma | D5671 |
| Gelatin | Merck | 1.04078 |
| Opti-MEM | Gibco | 31985 |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 |
| 8-well μ-Slides | ibidi | 80826 |
Referências
- Phair, R. D. Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins. Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).
- Meshorer, E., Girard, L. . Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. , (2008).
- Meshorer, E. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. . Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , (2009).
- Dundr, M., Misteli, T. Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).
- Ellenberg, J. Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis. J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).
- Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus. Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).
- Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know. Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).
- Phair, R. D., Misteli, T. Kinetic modelling approaches to in vivo imaging. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).
- Poser, I. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
- Sigal, A. Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells. Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).
- Cohen, A. A. Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug. Science. 322, 1511-1516 (2008).
