Nós ilustramos não-cirúrgico de entrega de materiais de teste para os pulmões de ratos anestesiados através da traquéia. Este método permite a exposição de pulmão a patógenos virais e bacterianas, citocinas, anticorpos, miçangas, químicos ou corantes. Iremos descrever colheita e processamento dos pulmões e dos gânglios linfáticos de drenagem de pulmão (LDLNs) para citometria de fluxo.
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Artigo de método
Não-cirúrgico instilação endotraqueal de camundongos com Análise de Pulmões e Drenagem Linfática Nodes Lung por citometria de fluxo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células fagocíticas, tais como macrófagos alveolares e células dendríticas pulmonares (PMD) continuamente amostra antígenos dos espaços alveolares nos pulmões. PMD, em particular, são conhecidos a migrar para o pulmão linfonodos de drenagem (LDLNs) onde apresentam antígenos inalados para células T iniciar uma resposta imune apropriada para uma variedade de imunógenos 1,2. Para modelar interações entre os pulmões e antígenos no ar em camundongos, os antígenos podem ser administradas por via intranasal 1,3,4, intratraqueal 5 ou 6 como aerossóis. Entrega por cada rota envolve distintas habilidades técnicas e limitações que precisam ser considerados antes de projetar um experimento. Por exemplo, a exposição intranasal e aerossol oferece antígenos para ambos os pulmões e do trato respiratório superior. Daí antígenos pode acessar o tecido linfóide associado nasal (NALT) 7, potencialmente complica a interpretação dos resultados. Além disso, engolir espirros, ea taxa de respiração do mouse também pode levar a inconsistências nas doses administradas. Embora o envolvimento do trato respiratório superior pode ser preferível para alguns estudos, pode complicar experimentos com foco em eventos especificamente iniciada nos pulmões. Neste cenário, a rota (it) intratraqueal é preferível, uma vez que fornece materiais de teste diretamente para os pulmões e ignora o NALT. Muitos protocolos que envolvem injeção de intubação ou cego da traquéia através da cavidade oral ou exposição cirúrgica da traquéia para acessar os pulmões. Relata-se um simples, consistente, o método não-cirúrgico para que a instilação. A abertura da traquéia é visualizado através de um laringoscópio e uma agulha torta sonda é inserido diretamente na traquéia para entregar o inóculo. Descrevemos também os procedimentos de colheita e processamento de LDLNs e pulmões para a análise do tráfico de antígeno por citometria de fluxo.
Protocolo
1. Antes do processo, preparar e recolher os itens a seguir
- Por favor, consulte a imagem da Figura 1a) e 1b) para a construção de uma plataforma de madeira para conter o mouse durante o procedimento.
- Mix digestão para os gânglios linfáticos - HBSS + 1.25mg/ml colagenase TypeIV ou 2,5 mg / ml de colagenase D
- Mix digestão para os pulmões - HBSS + 1 colagenase mg / ml
- Diluir esferas de látex (1:20) em PBS para injeção intraperitoneal para visualizar a LDLNs
Nota: LDLNs são pequenas e difíceis de encontrar. Para saber como encontrá-los, injetar 200μl das 01:20 diluída vermelho es....
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Discussão
Nós utilizamos esse protocolo para estudo do tráfico de esporos de Bacillus anthracis dos pulmões para o LDLNs. Para aplicações semelhantes, o número de partículas entregues para os pulmões devem ser cuidadosamente escolhidos para que o material injetado pode ser detectado no LDLNs por citometria de fluxo. Temos também utilizado com sucesso este método para a transferência adotiva de células e rotulagem das populações específicas de células do pulmão através de anticorpos fluorescente etiquetado. Além disso, es.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
| Stariner celular 70μm | BD | ||
| Anilina Azul | Pescador | A967-25 | |
| Agulha de Alimentação Animal | Popper and Sons Inc | 7920 | |
| Colagenase | Sigma | C2139 | |
| Colagenase TypeIV | Worthington | ||
| Colagenase D | Roche | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite Microesferas YG (0.5μm) | Polysciences, Inc | 17152 | |
| HBSS sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamina HCl (100mg/ml) | Hospira Inc | ||
| Lâmina de laringoscópio | PennCentury, Inc | Para o modelo LS-1 | Referem-se a www.penncentury.com |
| Laringoscópio de Fibra Óptica leve | WelchAllyn | 80814 | |
| Red Beads Fluorescente (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | Para injeção ip |
| Xilazina (100mg/ml) | Lloyd Laboratories |
Referências
- Grayson, M. H. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).
- GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. Division of labor between dendritic cell subsets of the lung. Mucosal Imm....
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Reimpressões e permissões
