Icke-kirurgisk intratrakeal instillation av möss med analys av lungor och Lungsjukas Tömning lymfkörtlar med flödescytometri
Summary
Vi illustrerar icke-kirurgisk leverans av provmaterial i lungorna på sövda möss via luftstrupen. Denna metod medger lung exponering mot bakteriella och virala patogener, cytokiner, antikroppar, pärlor, kemikalier eller färgämnen. Vi ytterligare beskriva skörd och förädling av lungorna och lungor dränerande lymfkörtlar (LDLNs) för flödescytometri.
Abstract
Fagocytiska celler såsom alveolära makrofager och lungceller dendritiska (MUL) prov kontinuerligt antigener från alveolarutrymmena i lungorna. Minst utvecklade länderna, i synnerhet, är kända för att migrera till lungan dränerande lymfkörtlar (LDLNs) där de presenterar inhalerade antigener till T-cellerna att initiera ett lämpligt immunsvar mot olika immunogens 1,2. Att modellera samspelet mellan lungorna och luftburna antigener i möss, kan antigen ges intranasalt 1,3,4, intratracheally 5 eller aerosoler 6. Leverans av varje rutt innebär olika tekniska färdigheter och begränsningar som måste beaktas innan utforma ett experiment. Till exempel ger intranasal och aerosoliserade exponering antigener till både lungor och övre luftvägarna. Därför antigener kan komma åt näsan tillhörande lymfatisk vävnad (NALT) 7, vilket kan försvåra tolkningen av resultaten. Dessutom kan svälja, nysningar och andning av musen leder också till inkonsekvenser i den levererade doser. Även medverkan av de övre luftvägarna kan vara att föredra för vissa studier kan det försvåra experiment som fokuserar på händelserna just inletts i lungorna. I den här inställningen är intratrakeal (IT) väg att föredra eftersom det ger testmaterial direkt in i lungorna och kringgår NALT. Många det injektion protokoll innebära antingen blinda intubation av luftstrupen via munhålan eller kirurgisk exponering av luftstrupe att få tillgång till lungorna. Häri beskriver vi en enkel, konsekvent, icke-kirurgisk metod för det instillation. Öppnandet av luftstrupe visualiseras med hjälp av en laryngoskopet och en böjd sondmatning nål införs därefter direkt in i luftstrupen för att leverera innoculum. Vi beskriver också rutiner för skörd och förädling av LDLNs och lungor för analys av antigen handel med flödescytometri.
Protocol
Discussion
Vi har utnyttjat detta protokoll för att studera handel med sporer av Bacillus anthracis från lungorna till LDLNs. Av liknande ansökningar bör antalet partiklar når lungorna väljas med omsorg så att det injicerade materialet kan påvisas i LDLNs med flödescytometri. Vi har också framgångsrikt använt denna metod för adoptiv transfer av celler och märkning av särskilda populationer lunga cell med fluorescerande antikroppar. Dessutom är den här metoden rutinmässigt används för att administrera b…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 70μm Cell stariner | BD | ||
| Aniline Blue | Fisher | A967-25 | |
| Animal Feeding needle | Popper and Sons Inc | 7920 | |
| Collagenase | Sigma | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | Worthington | ||
| Collagenase D | Roche | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc | 17152 | |
| HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Hospira Inc | ||
| Laryngoscope Blade | PennCentury, Inc | For Model LS-1 | Refer to www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optic Laryngoscope | WelchAllyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Beads (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | For i.p injection |
| Xylazine (100mg/ml) | Lloyd Laboratories |
Referências
- Grayson, M. H. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).
- GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. Division of labor between dendritic cell subsets of the lung. Mucosal Immunol. 1, 442-442 (2008).
- Bar-Haim, E. Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection. PLoS Pathog. 4, e1000211-e1000211 (2008).
- Kim, T. S., Braciale, T. J. Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses. PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).
- Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity. J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).
- Thomas, R. J. Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax. J Med Microbiol. , (2010).
- Kiyono, H., Fukuyama, S. NALT- versus Peyer’s-patch-mediated mucosal immunity. Nat Rev Immunol. 4, 699-699 (2004).
- Parungo, C. P. Lymphatic drainage of the peritoneal space: a pattern dependent on bowel lymphatics. Ann Surg Oncol. 14, 286-286 (2007).
- Jakubzick, C., Helft, J., Kaplan, T. J., Randolph, G. J. Optimization of methods to study pulmonary dendritic cell migration reveals distinct capacities of DC subsets to acquire soluble versus particulate antigen. J Immunol Methods. 337, 121-121 (2008).
- Higgins, D. M. Relative levels of M-CSF and GM-CSF influence the specific generation of macrophage populations during infection with Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 180, 4892-4892 (2008).
- Kool, M. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. J Exp Med. 205, 869-869 (2008).
- Costa, D. L., Lehmann, J. R., Harold, W. M., Drew, R. T. Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope. Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).
- Takahashi, S., Patrick, G. Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat. Lab Anim. 21, 31-31 (1987).
- Broeck, W. V. a. n. d. e. n., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).
