תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D
Summary
אנו מתארים שיטה פשוטה, מהירה של הפקת 3D רקמה דמוית spheroids יישום הפוטנציאל שלהם לכמת הבדלים תאים תאים אינטראקציות.
Abstract
מחקרים על לכידות התא התא התא תשתית הידבקות יש היסטורית שבוצעה על תרבויות monolayer חסיד מצעים נוקשה. תאים בתוך הרקמה, עם זאת, הם בדרך כלל עטוף בתוך מסת רקמת וצפופים שבו תאים ליצור חיבורים אינטימיים עם כמעט שכנים רבים עם רכיבים תאי מטריקס. לפיכך, המילייה כימיים כוחות פיזיים שחווים תאים בתוך רקמה 3D שונות באופן מהותי מאלה שחוו התאים גדל בתרבות monolayer. זה הוכח במידה ניכרת השפעה מורפולוגיה איתות הסלולר. כמה שיטות כבר המציאו כדי ליצור תרביות תאים 3D כולל אנקפסולציה של תאים ג'ל קולגן 1 או ביולוגי פיגומים 2. שיטות כאלה, בעוד שימושי, לא לשחזר את האדריכלות אינטימי ישיר תאים תאים הידבקות למצוא רקמות נורמליות. במקום זאת, הם יותר מקרוב מערכות תרבות המשוער שבו תאים בודדים מפוזרים באופן רופף בתוך meshwork 3D של מוצרי ECM. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה שבה תאים ממוקמים תלוי תרבות טיפה מודגרות בתנאים פיסיולוגיים עד שהם יוצרים spheroids 3D אמיתי שבו תאים נמצאים בקשר ישיר אחד עם השני עם רכיבים תאי מטריקס. השיטה אינה דורשת ציוד מיוחד והוא יכול להיות מותאם כוללים תוספת של כל סוכן ביולוגי בכמויות קטנות מאוד, כי יכול להיות עניין הבהרת השפעות על תאים תאים או תאים ECM אינטראקציה. השיטה יכולה לשמש גם לתרבות שיתוף שני (או יותר) אוכלוסיות תאים שונות על מנת להבהיר את התפקיד של אינטראקציות תאים תאים או תאים ECM של ציון יחסים מרחביים בין תאים. Cell-cell לכידות התא ECM הידבקות הם אבני היסוד של מחקרים של אינטראקציה עובריים, התפתחות תאים סרטניים, סטרומה בפלישה ממאיר, ריפוי פצעים, ועבור יישומים הנדסת רקמות. זו שיטה פשוטה תספק אמצעי ליצירת רקמות כמו אגרגטים הסלולר למדידת נכסים biomechanical או לניתוח מולקולרית ביוכימיים במודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית.
Protocol
Discussion
מחקרים הראו כי תאי culturing בהקשר תלת ממדי (3D) מייצרת מורפולוגיה הסלולר איתות מובהק בהשוואה מערכת נוקשה (2D) דו מימדי התרבות 9. לדוגמה, פיברובלסטים המאוכלסים ג'ל קולגן להוכיח כי מורפולוגיה פיברובלסטים ב-3D הוא שונה לגמרי מזו שנצפתה 2D 10,11. באופן דומה, תרבות 3D ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחבר מבקש להודות לד"ר Dongxuan ג'יאה לקבלת סיוע טכני. חלק מן התמונות המופיעות במאמר זה היו בשיתוף עם ד"ר מלקולם ש שטיינברג, המחלקה לביולוגיה מולקולרית, אוניברסיטת פרינסטון. המחבר רוצה גם להודות משרד הביטחון תוכנית סרטן הערמונית מחקר (מענקים-PC ו-PC 030,482 991,552) ו / NCI NIH (מענק R01CA118755) על תמיכתם הנדיבה.
Materials
- automatic cell counter (BioRad TC10)
- shaking water bath with CO2 gable cover Model 3540 (Lab-line)
Referências
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).
- Davis, G. S., Phillips, H. M., Steinberg, M. S. Germ-layer surface tensions and "tissue affinities" in Rana pipiens gastrulae: quantitative measurements. Dev Biol. 192, 630-644 (1997).
- Schotz, E. M. Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning. HFSP J. 2, 42-56 (2008).
- Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).
- Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Dev Biol. 278, 255-263 (2005).
- Li, D. Expression of the casein kinase 2 subunits in Chinese hamster ovary and 3T3 L1 cells provides information on the role of the enzyme in cell proliferation and the cell cycle. J Biol Chem. 274, 32988-32996 (1999).
- Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122, 1611-1620 (1996).
- Wendt, D., Riboldi, S. A., Cioffi, M., Martin, I. Potential and bottlenecks of bioreactors in 3D cell culture and tissue manufacturing. Adv Mater. 21, 3352-3367 (2009).
- Berry, D. P., Harding, K. G., Stanton, M. R., Jasani, B., Ehrlich, H. P. Human wound contraction: collagen organization, fibroblasts, and myofibroblasts. Plast Reconstr Surg. 102, 124-131 (1998).
- Grinnell, F. Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices. Trends Cell Biol. 13, 264-269 (2003).
- Wang, F. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14821-14826 (1998).
- Weaver, V. M. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Boudreau, N., Werb, Z., Bissell, M. J. Suppression of apoptosis by basement membrane requires three- dimensional tissue organization and withdrawal from the cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 3509-3513 (1996).
- Croix, B., Rak, J. W., Kapitain, S., Sheehan, C., Graham, C. H., Kerbel, R. S. Reversal by hyaluronidase of adhesion-dependent multicellular drug resistance in mammary carcinoma cells. J. Nat. Cancer Inst. 88, 1285-1296 (1996).
- Bissell, M. J. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).
- Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 523-534 (2009).
- Napolitano, A. P. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43, 494-496 (2007).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103, 655-663 (2009).
