Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Summary

Nós descrevemos um método simples e rápida de gerar tecido 3D-como esferóides e sua potencial aplicação para quantificar as diferenças de interações célula-célula.

Abstract

Estudos de célula-célula e célula substrato coesão-adesão têm sido historicamente realizados em culturas de monocamada aderente sobre substratos rígidos. Células dentro de um tecido, no entanto, normalmente são encerrados dentro de uma massa de tecido de forma compacta em que as células estabelecer conexões íntimas com muitas quase-vizinhos e com componentes da matriz extracelular. Assim, o meio químico e forças físicas experimentadas por células dentro de um tecido 3D são fundamentalmente diferentes do que aqueles experimentados por células cultivadas em cultura em monocamada. Isto tem sido demonstrado que marcadamente impacto morfologia celular e sinalização. Vários métodos têm sido desenvolvidos para gerar culturas de células em 3D, incluindo encapsulamento de células em géis de colágeno ou em ^um biomaterial andaimes ^2. Tais métodos, embora úteis, não recapitular a arquitetura de adesão íntima direto célula-célula encontrada em tecidos normais. Ao contrário, eles mais de perto os sistemas aproximados de cultura em que as células individuais são frouxamente dispersas dentro de uma malha 3D de produtos ECM. Aqui, descrevemos um método simples em que as células são colocadas em cultura pendurado queda e incubados em condições fisiológicas, até que a verdadeira forma esferóides 3D em que as células estão em contato direto uns com os outros e com componentes da matriz extracelular. O método não requer equipamento especializado e pode ser adaptado para incluir a adição de qualquer agente biológico em quantidades muito pequenas que podem ser do seu interesse na elucidação efeitos sobre célula-célula ou célula-ECM interação. O método também pode ser usado para co-cultura dois (ou mais) diferentes populações de células, de modo a elucidar o papel das interações célula-célula ou célula-ECM na especificação de relações espaciais entre as células. Célula-célula e célula coesão ECM-adesão são os pilares dos estudos de desenvolvimento embrionário interação celular, tumor de estroma na invasão maligna, cicatrização de feridas, e para aplicações de engenharia de tecidos. Este método simples irá fornecer um meio de gerar tecido celular-como agregados para a medição de propriedades biomecânicas ou para análise molecular e bioquímica em um modelo fisiologicamente relevantes.

Protocol

1. Preparação de uma suspensão de células Único

1. Culturas de células aderentes devem ser cultivadas a confluência de 90%, quando então monocamadas devem ser lavados duas vezes com PBS. Depois de drenar bem, adicionar 2 ml (para 100 placas mm) de 0,05% de tripsina-EDTA 1 mM, e incubar a 37 ° C até que as células detach. Parar tripsinização adicionando 2 ml de meio completo e gentilmente usar uma pipeta de 5 ml para triturar a mistura até que as células estão em suspensão. Transferência de células para um tubo de 15 ml.
2. Adicionar 40 mL de uma 10 mg / ml DNAse estoque e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente. Brevemente Vortex e centrifugar a ....

Discussion

Estudos têm demonstrado que a cultura de células em um contexto tridimensional (3D) produz morfologia celular e sinalização distintas quando comparado a um rígido sistema de cultura de duas dimensões (2D) ^9. Por exemplo, géis de fibroblastos de colágeno povoadas demonstram que a morfologia de fibroblastos em 3D é bastante distinta da observada em 2D ^10,11. Da mesma forma, a cultura 3D pode induzir a diferenciação de tecidos específicos de células epiteliais mamárias. Sistemas de cultura 3D têm sido.......

Materials