Phage 'Bioluminescent' Reporter per il rilevamento di batteri patogeni di categoria A
Summary
Un metodo semplice per l'identificazione di batteri patogeni priorità è quella di utilizzare fago giornalista geneticamente modificato. Queste fago reporter, che sono specifici per la loro specie ospite particolare, sono in grado di trasduzione rapidamente una risposta bioluminescente segnale alle cellule ospite. Qui, descriviamo l'uso del fago giornalista per la rilevazione di<em> Yersinia pestis</em>.
Abstract
Yersinia pestis e Bacillus anthracis sono di categoria A batteri patogeni che sono gli agenti causali della peste e antrace, rispettivamente 1. Anche se la presenza naturale di entrambe le malattie 'è ora relativamente rara, la possibilità di gruppi terroristici con questi patogeni come arma biologica è reale. A causa della intrinseca comunicabilità della malattia, rapido decorso clinico, e alto tasso di mortalità, è fondamentale che un focolaio essere rilevati rapidamente. Pertanto le metodologie che consentono il rilevamento rapido e la diagnosi sono essenziali per garantire l'attuazione immediata di misure di sanità pubblica e l'attivazione della gestione delle crisi.
Fago ricombinante giornalista può fornire un approccio rapido e specifico per l'individuazione di Y. pestis e B. anthracis. I Centri per il Controllo delle Malattie e la Prevenzione attualmente utilizzano il classico test lisi dei fagi per l'identificazione ha confermato di questi batteri patogeni 2-4. Questi test sfruttare naturale fago che sono specifici e litico per i loro ospiti batterici. Dopo una crescita durante la notte del batterio coltivato in presenza del fago specifico, la formazione di placche (lisi batterica) fornisce una identificazione positiva del target batterico. Anche se questi test sono robusti, soffrono da tre difetti: 1) sono di laboratorio, 2) che richiedono l'isolamento e la coltura batterica dal campione sospetto, e 3) prendono 24-36 ore per essere completato. Per affrontare questi problemi, ricombinante "light-tag" fago giornalista sono stati geneticamente modificati, integrando le Vibrio harveyi luxAB geni nel genoma di Y. pestis e B. anthracis fago specifico 5-8. La risultante dei fagi giornalista luxAB sono stati in grado di rilevare i loro target specifico, mediante una rapida (pochi minuti) e sensibile che conferisce un fenotipo bioluminescente di cellule riceventi. È importante sottolineare che il rilevamento è stato ottenuto sia con cellule riceventi coltivate o con campioni clinici mock-infettate 7.
A scopo dimostrativo, qui si descrive il metodo per il fago-mediata rilevamento di un noto Y. pestis isolare con un fago luxAB giornalista costruito dalla peste CDC diagnostica fago ΦA1122 6,7 (Figura 1). Un metodo simile, con piccole modifiche (ad esempio cambiamento della temperatura di crescita e media), possono essere utilizzati per la rilevazione di B. anthracis isola con il B. anthracis fago Wβ reporter:: luxAB 8. Il metodo descrive il fago-mediata trasduzione di un fenotipo biolumescent ad essere coltivato Y. pestis cellule che vengono successivamente misurata con un luminometro per micropiastre. I principali vantaggi di questo metodo il test tradizionale lisi dei fagi è la facilità di utilizzo, i risultati rapidi e la possibilità di testare campioni multipli simultaneamente in un formato a 96 pozzetti di micropiastre.
Figura 1. Schema di rilevamento. I fagi sono mescolati con il campione, il fago infetta il cellulare, luxAB sono espressi, e il bioluminesces cellula. Trattamento dei campioni non è necessaria; il fago e le cellule sono mescolate e successivamente valutate per la luce.
Protocol
Discussion
Questo metodo dimostra la capacità del fago giornalista per rilevare rapidamente Y. pestis dal fago giornalista può trasdurre una risposta bioluminescente segnale colto Y. pestis cellule entro 20 minuti dopo l'aggiunta dei fagi. Il fago giornalista è anche in grado di rilevare direttamente Y. pestis in matrici clinica, senza il presupposto di isolamento e 7 successiva coltivazione. Rispetto ai test standard di lisi fagica che in genere richiedono 48 ore per il completamento, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca Piccole Imprese per l'Innovazione del National Institutes of Health (NIAID, 1R43AI082698-01) e l'USDA Istituto Nazionale di Alimentazione e l'Agricoltura (NIFA, 2009-33610-20028).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Difco LB agar, Miller | VWR | 90003-346 |
| Difco LB broth, Miller | VWR | 90003-350 |
| 17 x 100 mm culture tubes | USA Scientific | 1485-0810 |
| n-Decanal | Sigma | D7384 |
| Veritas microplate luminometer | Turner Biosystems | 9100-001 |
| Microlite microtiter 96-well plate | VWR | 62402-984 |
Referências
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