الفرز الفائق الإنتاجية وBiosensing مع نيون C. ايليجانس سلالات
Summary
إجراءات لبناء زراعة السائل وصرف<em> C. ايليجانس</emيوصف> سلالات معربا عن البروتينات مراسل الفلورسنت التي لا تتطلب معدات باهظة الثمن الفرز. ويمكن تطبيق هذا النهج في العديد من محرض<em> C. ايليجانس</em> الجينات لاكتشاف المخدرات أو biosensing من الملوثات.
Abstract
الفرز الفائق الإنتاجية (HTS) هو طريقة فعالة لتحديد جهري من العمليات البيولوجية الكيميائية. ومع ذلك ، غالبا ما توجد العديد من المركبات التي تم تحديدها في شاشات باستخدام نماذج ثقافة الخلية لتكون سامة أو غير نشط في الجسم الحي عقاقيري 1-2. يمكن الفرز في النماذج الحيوانية كلها تساعد على تجنب هذه المزالق وتبسيط مسار التنمية المخدرات.
ايليجانس جيم هو كائن نموذج متعددة الخلايا مناسبة تماما للHTS. انها صغيرة (<1 مم) ويمكن الاستغناء اقتصاديا وتربيتها في السوائل. جيم ايليجانس هي أيضا واحدة من أكثر النماذج الحيوانية الانقياد تجريبيا يتيح التعرف السريع والمفصل لوضع المخدرات مقابل عمل 3.
وصفنا بروتوكول للزراعة وصرفها من سلالات الفلورسنت C. ايليجانس الإنتاجية العالية لفحص المكتبات الكيميائية أو الكشف عن الملوثات البيئية التي تغير التعبير عن جينة معينة. تزرع أعداد كبيرة من الديدان متزامنة تنمويا في الثقافة السائل ، وحصادها ، وغسلها ، وعلقت في مناطق ذات كثافة المعرفة. ثم تضاف الديدان إلى الأسود ، لوحات 384 جيدا مسطحة باستخدام موزع تحوي السائل. يمكن إضافة جزيئات صغيرة من مكتبة الكيميائية أو عينات الاختبار (على سبيل المثال ، الماء ، الغذاء ، أو التربة) من الآبار مع الديدان في الجسم الحي ، ويقاس في الوقت الحقيقي مع كثافة مضان قارئ microplate مضان. ويمكن تكييف هذه الطريقة على أي الجينات محرض في C. ايليجانس التي مراسل مناسبة متاحة. وتعرف جيدا العديد من الإجهاد محرض والمسارات التنموية في الترانسكربتي C. ايليجانس والسلالات المعدلة وراثيا GFP مراسل موجودة بالفعل بالنسبة للكثيرين منهم 4. عندما يقترن المعدلة وراثيا للصحفيين ان المناسبة ، يمكن استخدام أسلوب لدينا للكشف عن جهري ممرا أو المقايسات لتطوير جهاز الاستشعار البيولوجي قوية للملوثات البيئية.
نحن لدينا تثبت C. ايليجانس الثقافة والاستغناء عن بروتوكول مع مقايسة HTS ضعنا لرصد C. 'ن' ايليجانس قبعة عامل النسخ طوق SKN – 1. SKN – 1 و Nrf2 لها نديد الثدييات تنشيط الجينات cytoprotective خلال الاكسدة وأجنبي بيولوجيا 5-10. Nrf2 الثدييات يحمي من الاضطرابات المتعلقة بالعمر عديدة مثل السرطان ، وتنكس عصبي ، والتهاب مزمن ، وأصبح هدفا رئيسيا الكيميائي 11-13. يستند على فحص لدينا مراسل GFP المعدلة وراثيا لSKN – 1 هدف الجينات GST -4 14 الذي يشفر 6 – S ترانسفيراز الجلوتاثيون. مراسل GST -4 هو أيضا جهاز الاستشعار البيولوجي للمواد الكيميائية وأجنبي بيولوجيا الاكسدة التي تنشط SKN – 1 ، ويمكن استخدامها للكشف عن مستويات منخفضة من الملوثات ، مثل الأكريلاميد وميثيل الزئبق 15-16.
Protocol
Discussion
نقدم طريقة لزراعة وتوزيع أعداد كبيرة من الديدان الخيطية جينيا. والمعدات المستخدمة لزراعة الديدان هو المعيار لأداء مختبرات الاستنساخ الجزيئي وسائل ومعدات مناولة الاستشعاع معيارية للمختبرات معالجة أعداد كبيرة من microplates. الأساليب الأخرى الاستغناء أعداد كبيرة من يعي?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقدمت جيم ايليجانس الجينات المحورة من قبل مركز علم الوراثة انواع معينة (جامعة مينيسوتا ، مينيابوليس ، مينيسوتا). وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS0667678 R21 – 01 إلى KS. وشارك جميع المؤلفين في مجال جمع وتحليل وتفسير البيانات. شارك CKL ، KS ، ومؤسسة البترول الكويتية في كتابة وتنقيح المخطوطات.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy™ HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled (352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nunc | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone | ACROS | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
Referências
- Simeonov, A. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery. Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).
- Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).
- Hasegawa, K. Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).
- Tullet, J. M. A. Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans. Cell. 132, 1025-1038 (2008).
- Oliveira, R. P. Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf. Aging Cell. , (2009).
- Park, S. -. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8, 258-269 (2009).
- Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway. Antioxid Redox Signal. , (2010).
- Kwak, M. K., Kensler, T. W. Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention. Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).
- Leiser, S. F., Miller, R. A. Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice. Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).
- Link, C. D., Johnson, C. J. Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).
- Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity. Toxicol Sci. , (2010).
- Hasegawa, K. A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food. Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).
- Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).
- Hope, I. A. . C. elegans, a Practical Guide. , (2005).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).
