הליך culturing נוזלי מבוסס מחלק של<em> ג elegans</em> זני לבטא חלבונים כתב ניאון מתואר כי אינו דורש ציוד יקר מיון. גישה זו ניתן להחיל ועין מתנהלת רבים<em> ג elegans</em> גנים לגילוי סמים או biosensing של מזהמים.
תפוקה גבוהה ההקרנה (HTS) היא גישה חזקה לזיהוי מאפננים כימיים של תהליכים ביולוגיים. עם זאת, תרכובות רבות שזוהו באמצעות מסכי התרבות מודלים התא נמצאים לעתים קרובות להיות רעילים או פעילים פרמקולוגית in vivo 1-2. הקרנת במודלים של בעלי חיים שלם יכול לעזור למנוע מהמלכודות הללו ולייעל את הדרך לפיתוח תרופות.
סי אלגנס הוא אורגניזם מודל תאיים גם מתאים HTS. הוא קטן (<1 מ"מ) יכול להיות מתורבת כלכלית לוותר על נוזלים. ג elegans הוא גם אחד במודלים של בעלי חיים הכי ממושמע בניסוי המאפשר זיהוי מהיר ומפורט של התרופה למצב של פעולה 3.
אנו מתארים פרוטוקול עבור culturing מחלק זנים הניאון של C. elegans להקרנה תפוקה גבוהה של ספריות כימי או זיהוי של מזהמים סביבתיים אשר משנים את הביטוי של גן מסוים. כמות גדולה של תולעים מסונכרן התפתחותית גדלים בתרבות נוזלי, שנקטפו, התרחצתי, תלוי בצפיפות מוגדר. תולעים מתווספים ואז שחור, השטוחה 384 גם באמצעות צלחות מנפק נוזל peristaltic. מולקולות קטנות מספריית כימיים או דגימות הבדיקה (למשל, מזון, מים או אדמה) ניתן להוסיף בארות עם תולעים. In vivo, בזמן אמת, עוצמת הקרינה נמדדת עם הקורא microplate פלואורסצנטי. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לכל גן ועין מתנהלת ב C. elegans עבורו כתב מתאים זמין. הלחץ ועין מתנהלת הרבה מסלולים תעתיק התפתחותיים מוגדרים היטב ב C. elegans ו-GFP זנים מהונדס כתב כבר קיים עבור רבים מהם 4. בשילוב עם הכתבים מהונדס מתאים, השיטה שלנו יכולה לשמש מסך עבור מאפננים מסלול או לפתח מבחני biosensor חזקים מזהמים סביבתיים.
אנו מדגימים C. שלנו elegans תרבות מחלק פרוטוקול עם assay HTS שפיתחנו כדי לפקח על C. 'n' אלגנס כובע גורם שעתוק צווארון SKN-1. SKN-1 ו Nrf2 יונקים שלה homologue להפעיל גנים cytoprotective במהלך סטרס חמצוני xenobiotic 5-10. Nrf2 מגן יונקים מגיל בהפרעות הקשורות רבות כגון סרטן, ניוון מוחיים, דלקת כרונית הפכה ליעד מרכזי כימותרפיות 11-13. Assay שלנו מבוססת על עיתונאי ה-GFP מהונדס עבור SKN-1 היעד הגן GST -4 14, אשר מקודד גלוטתיון-s 6 transferase. הכתב GST -4 גם biosensor כימיקלים xenobiotic ו חמצוני כי להפעיל SKN-1 והוא יכול לשמש כדי לזהות רמות נמוכות של מזהמים כגון acrylamide ו-מתיל כספית 15-16.
אנו מציגים שיטה culturing מחלק מספר גדול של נמטודות מהונדס. הציוד המשמש תולעים culturing הוא סטנדרטי עבור מעבדות ביצוע שיבוט מולקולרי והטיפול נוזלי וציוד הקרינה הוא סטנדרטי עבור מעבדות לעיבוד כמויות גדולות של microplates. שיטות אחרות של מחלק מספר גדול של חיים ג elegans דורשים הח?…
The authors have nothing to disclose.
סי אלגנס transgenes סופקו על ידי גנטיקה Caenorhabditis מרכז (אוניברסיטת מינסוטה, במיניאפוליס, מינסוטה). עבודה זו נתמכה על ידי NIH R21 מענק NS0667678-01 ל KS. כל המחברים שהשתתפו באוסף, ניתוח ופרשנות של נתונים. CKL, KS, ו KPC השתתפו בכתב לתיקון כתב היד.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
Synergy™ HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled (352) 284-2531 | |
384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
Breathable sealing tape | Nunc | 241205 | |
(5-hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone | ACROS | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |