High-throughput screening och biosensing med fluorescerande C. elegans Stammar
Summary
Ett förfarande för flytande-baserade odling och utlämning av<em> C. elegans</em> Stammar uttrycka fluorescerande reporter proteiner beskrivs som inte kräver dyra sorteringsutrustning. Denna metod kan tillämpas på många inducerbara<em> C. elegans</em> Gener för läkemedelsutveckling eller biosensing av föroreningar.
Abstract
High-throughput screening (HTS) är en kraftfull metod för att identifiera kemiska modulatorer av biologiska processer. Men många föreningar identifierats i skärmarna med hjälp av modeller cellodling ofta visat sig vara giftiga eller farmakologiskt inaktiva in vivo 1-2. Screening helt djurmodeller kan hjälpa till att undvika dessa fallgropar och effektivisera vägen till läkemedelsutveckling.
C. elegans är en flercellig modellorganism lämpar sig väl för HTS. Den är liten (<1 mm) och kan vara ekonomiskt odlas och distribueras i vätskor. C. elegans är också en av de mest experimentellt tractable djurmodeller behövs för en snabb och detaljerad kartläggning av droger mode-of-åtgärd 3.
Vi beskriver ett protokoll för odling och utlämning fluorescerande stammar av C. elegans för high-throughput screening av kemiska bibliotek eller upptäckt av miljögifter som ändrar uttrycket av en specifik gen. Ett stort antal utvecklingsmässigt synkroniserad maskar odlas i flytande kultur, skördade, tvättade och suspenderade i en definierad densitet. Maskar läggs därefter till svart, flatbottnade 384-brunnars plattor med en peristaltiska flytande dispenser. Små molekyler från ett kemiskt bibliotek eller prover (t ex vatten, mat eller jord) kan läggas till brunnar med maskar. In vivo är realtid fluorescensintensiteten mäts med en fluorescens mikroplattor läsare. Denna metod kan anpassas till alla inducerbara genen i C. elegans som en lämplig reporter är tillgänglig. Många inducerbara stress och utvecklande transkriptionsvägar är väl definierade i C. elegans och GFP transgena stammar reporter finns redan för många av dem 4. I kombination med lämplig transgena reportrar, kan vår metod kan användas för att screena för väg modulatorer eller att utveckla robusta biosensor analyser för miljögifter.
Vi visar vår C. elegans kultur och utlämning protokoll med en HTS analys vi utvecklat för att övervaka C. elegans cap 'n' kragen transkriptionsfaktor SKN-1. SKN-1 och dess däggdjur Nrf2 homolog aktivera cytoprotective gener under oxidativ och xenobiotiska stressen 5-10. Nrf2 skyddar däggdjur från många åldersrelaterade sjukdomar såsom cancer, neurodegeneration och kronisk inflammation och har blivit ett stort kemoterapeutiska mål 11-13. Vår analys är baserad på en GFP transgena reporter för SKN-1 målgenen gst -4 14, som kodar en glutation-S transferas 6. Den GST -4 reportern är också en biosensor för xenobiotiska och oxidativ kemikalier som aktiverar SKN-1 och kan användas för att detektera låga halter av föroreningar som akrylamid och metylkvicksilver 15-16.
Protocol
Discussion
Vi presenterar en metod för odling och utlämning stort antal transgena nematoder. Den utrustning som används för odling maskar är standard för laboratorier som utför molekylär kloning och vätskehantering och fluorescens utrustning är standard för laboratorier bearbetning stort antal mikroplattor. Andra metoder för dispensering stort antal av levande C. elegans kräver dyra partikelfilter sorteringsutrustning 19. Den Pgst-4:: GFP-analysen kan användas för att screena för liten …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C. elegans transgener lämnades av Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, Minneapolis, MN). Detta arbete stöddes av NIH R21 bevilja NS0667678-01 till KS. Alla författare har deltagit i insamling, analys och tolkning av data. CKL, KS, och KPC deltagit i att skriva och revidera manuskriptet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy™ HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled (352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nunc | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone | ACROS | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
Referências
- Simeonov, A. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery. Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).
- Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).
- Hasegawa, K. Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).
- Tullet, J. M. A. Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans. Cell. 132, 1025-1038 (2008).
- Oliveira, R. P. Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf. Aging Cell. , (2009).
- Park, S. -. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8, 258-269 (2009).
- Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway. Antioxid Redox Signal. , (2010).
- Kwak, M. K., Kensler, T. W. Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention. Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).
- Leiser, S. F., Miller, R. A. Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice. Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).
- Link, C. D., Johnson, C. J. Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).
- Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity. Toxicol Sci. , (2010).
- Hasegawa, K. A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food. Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).
- Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).
- Hope, I. A. . C. elegans, a Practical Guide. , (2005).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).
