Мышь модели окклюзии средней мозговой артерии

Summary

Мы демонстрируем в видео способе получения окклюзии средней мозговой артерии у взрослых мышей использования внутрипросветного мононити. Мы также показываем, как оценить степень инфаркт мозга по 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорида (ТТК) окрашивания.

Abstract

Инсульт является наиболее распространенным фатальной неврологической болезни в США ^1. Большинство ударов (88%) в результате блокирования сосудов головного мозга (ишемический инсульт) ^2. Так как большинство ишемических инсультов (~ 80%) имеют место на территории средней мозговой артерии (СМА) ^3, многих животных инсульта моделей, которые были разработаны сосредоточили свое внимание на этой артерии. Внутрипросветный модель мононити средней мозговой артерии (MCAO) включает вставки из хирургической нити в наружной сонной артерии и резьбы его вперед на внутренней сонной артерии (ВСА) до кончика закрывает происхождения MCA, что приводит к прекращению кровотока и последующего инфаркта мозга в ⁴ территории MCA. Метод может быть использован для моделирования постоянной или транзиторной окклюзии ^5. Если шов удаляется через определенный интервал (30 мин, 1 час, или 2 ч), реперфузия достигается (переходные MCAO), если нить остается на месте (24 ч) процедура может быть использован как модель непрерывного MCAO . Этот метод не требует удаление фрагментов костей черепа, нейрохирургические процедуры для удаления части черепа, которые могут повлиять на внутричерепное давление и температура ^6. Она стала наиболее часто используемый метод, чтобы имитировать постоянное и временное координационного ишемии головного мозга у крыс и мышей ^7,8. Для оценки степени инфаркт мозга, мы пятна мозга ломтики с 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорид (ТТС) для выявления ишемической ткани мозга ^9. В этом видео, мы демонстрируем MCAO метод и определение размера инфаркта окрашиванием ТТК.

Protocol

1. Метод MCAO Этот протокол был одобрен Уходу за животными и использование комитетов UCSF и Кентского государственного университета, а также соблюдает Национального института здоровья руководящих принципов для использования подопытных животных. Вырезать 5-0 мононити шва (Harvard Аппарат, Холлистон, М. А.) в 20 мм сегменты. Круглый кончик каждого сегмента при нагревании его рядом cauterizer (Braintree Научные, Inc, Braintree, MA). Измерьте диаметр кончика использованием микрометра (Applied изображения Inc, Рочестер, штат Нью-Йорк). Мы используем шва с конечным диаметром кончика 0.21-0.22 мм для мыши с массой тела 25-30 г. Стерилизовать всех хирургических инструментов в автоклаве (минимум 121 ° С, 15 PSI, в течение 15 мин). Sanitize таблице хирургии и связанного с ним оборудования с использованием 70% этанола. Обезболить 8-12 недельных мышей (25-30 г) с 5% изофлуран (Aerrane, Baxter, Дирфилд, штат Иллинойс) в 30% O 2 / 70% N 2 O использованием V-10 Анестезия системы (VetEquip, Inc ., Плезантон, Калифорния). После вводного наркоза, снижение уровня изофлуран и поддерживать его на уровне 1,5%. Наведите в положении лежа на грелку. Вставьте ректального датчика, а также контролировать и поддерживать температуру тела между 36.5-37.5 ° С с использованием TR-200 теплокровных температуры системы (Fine науки Инструменты Inc, Foster City, CA). Бритье мех на вентральной области шеи с электрическими ножницами (Braintree Scientific) подвергать кожу. Лечить хирургического сайте, используя три заявки из 70% этанола. Под стерео рассекает микроскоп (Nikon, Япония), чтобы 1 см в длину средней линии разрез на шее. Используйте преднатяжителями (Braintree Scientific) подвергать операционного поля и определить правой общей сонной артерии (ССА), внешние сонной артерии (ЭКА), и внутренней сонной артерии (ВСА). Аккуратно вскрыть артерии свободными от окружающих нервов и фасции. Рассеките ЭКА дальнейшего дистально и коагулируют ЭКА и ее превосходной артерии щитовидной железы (STA) филиала использованием биполярного коагулятора (Howard Инструмент Inc, Tuscaloosa, AL). Вырезать ЭКА и ГНА в коагулируют сегменте. Свободно два галстука 8-0 швов шелка вокруг культи ЕЦА. Применить сосудистой зажим (Fine Инструменты наук) в бифуркации ОСА в ЭКА и ICA. Сделайте небольшой надрез в конце ЭКА пень с Vannas стиле весны ножницы (Fine Инструменты наук). Измерьте и запишите длину 5-0 мононити шва закругленным кончиком. Вставьте шва в разрез и заранее, чтобы зажим. Затяните два шелковых швов вокруг просвета просто достаточно, чтобы обеспечить еще сохранить подвижность в жилых мононити шва. Снимите зажим бифуркации. Аккуратно заранее мононити шва из просвета ЭКА в МКА на расстоянии 9-10 мм за бифуркации ОСА окклюдировать происхождения MCA. Длительность операции составляет около 30-45 мин. Шовный разрез на шее и место мышь в 35 ° C кормящих поле, чтобы оправиться от наркоза, и вернуть ее в клетку. Как правило, он занимает 5-10 мин для мышей, чтобы оправиться от наркоза. Для выполнения переходных MCAO, исследователь может повторно анестезию мыши и снять шов обратно в культю ЭКА после периода времени, обычно от 0,5-2 ч. Двадцать четыре часа после индукции MCAO, обезболить мышь с 5% изофлуран и усыпить его, шейки дислокации. Обезглавьте мыши и собирать мозга. Нарежьте мозга коронки на четыре 2-мм кубиков с матрицей мозга (Braintree Scientific) на льду. Инкубируйте мозга ломтики в 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорид (ТТС) (Sigma-Aldrich) в 1X PBS в течение 20 мин при комнатной температуре, чтобы определить размер и степень миокарда. Fix мозга срезов в 10% нейтральный буферный формалин решение (Sigma-Aldrich) при 4 ° С до визуализации. Степень миокарда может быть определена количественно, как описано в протоколе Юпитера 955 ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ) 9. 2. Представитель Результаты Инфаркты порожденных MCAO видны в полосатом теле и дорсолатеральной коры головного мозга. Полосатого тела более чувствительна к ишемии, чем коры головного мозга. Тридцать минут MCAO будет производить инфаркта только в полосатом теле, а более одного часа MCAO может повредить как стриатуме и коре головного мозга. Через 24 ч постоянной MCAO, общий процент инфаркта ~ 40 ± 5% от полушарии и смертности после операции составляет ~ 10%. Мы исключаем мышей от дальнейших исследований, если чрезмерное кровотечение во время операции, время работы превышает 90 мин, мыши не могут оправиться от наркоза в течение 15 мин, или кровотечение в мозгу ломтиками или у основания круг Уиллис во вскрытии . 61/2761fig1.jpg "ALT =" Рисунок 1 "/> Рисунок 1. Представителю образы TTC-окрашенных ломтики мозга (корональные уровня 1-4) после 24 часов постоянного MCAO. В живой ткани TTC ферментативно сократилось на дегидрогеназ с 1,3,5-triphenylformazan (ВПС), который является красный цвет, а в некротических областях она остается белым из-за отсутствия такого ферментативную активность. Таким образом, область миокарда можно определить по его белым цветом из-за отсутствия преобразования TTC в ВПС. Примечание: TTC несколько тепла и света, поэтому нестабильный защитить окрашенные срезы от тепла и света как можно больше.

Discussion

MCAO у мышей обычно используется для модели фокальной ишемии мозга у людей. Использование мыши для хода исследования стало более частым из-за наличия трансгенных и нокаут штаммов. Есть несколько ответственных деталей отметить в протоколе:

1. Это необходимо для поддержания температуры тела мыши во время операции и, прежде чем она полностью оправится от анестезии. Температура тела оказывает влияние на степень миокарда; переохлаждение уменьшается, а гипертермия увеличивает размер инфаркта.
2. Хотя разоблачение и изоляцию ОСО и ЭКА, избежать повреждения близлежащих блуждающего нерва и трахеи, что может увеличить размер инфаркта и снижению жизнеспособности.
3. Никогда не вставляйте мононити шва более 10 мм проходит бифуркации. Шов вставлен слишком далеко может перфорировать передней мозговой артерии и в результате кровоизлияния в мозг. Сопротивление может быть чувствовал, когда шов передовых около 9-10 мм за точкой бифуркации. В этом случае исследователь должен остановить продвижение шва и подтвердить расстояния.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Isoflurane	Chemical	Aerrane, Baxter	95045-588
V-10 Anesthesia system	Equipment	VetEquip	901807
TR-200 Temp Controller	Equipment	Fine Science Tools	21060
Electric clipper	Equipment	Braintree	CLP-9931
Dissecting microscope	Equipment	Nikon	SMZ745T
Retractor system	Equipment	Braintree	ACD-014
Bipolar coagulator	Equipment	Howard Instrument	64000
Silk suture	Material	Harvard Apparatus	510479
Monofilament suture	Material	Harvard Apparatus	723351
Vascular clamp	Equipment	Fine Science Tools	00396-01
Vannas scissor	Equipment	Fine Science Tools	15000-08
Brain matrix	Equipment	Braintree	BS-2000C
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma-Aldrich	T8877
10% neutral buffer formalin	Chemical	Sigma-Aldrich	HT5011