We beschrijven hier een methode voor biopsying olfactorische slijmvlies van de rat en mens neusholten. Deze biopten kunnen worden gebruikt voor zowel het identificeren van moleculaire afwijkingen in de hersenen ziekten of isoleren van multipotente volwassen stamcellen die gebruikt kunnen worden voor mobiele transplantatie in diermodellen van de hersenen trauma / ziekte.
De olfactorische mucosa, gelegen in de neusholte, is belast met het opsporen van geuren. Het is ook de enige zenuwweefsel dat is blootgesteld aan de externe omgeving en goed bereikbaar in elk levend individu. Als gevolg hiervan, dit weefsel is uniek voor iedereen gericht op moleculaire afwijkingen in de hersenen pathologische identificeren of volwassen stamcellen te isoleren voor celtherapie.
Moleculaire afwijkingen in de hersenen ziekten zijn vaak bestudeerd met behulp van zenuwweefsel monsters verzameld post-mortem. Echter, dit materiaal heeft tal van beperkingen. In tegenstelling, de olfactorische slijmvlies is gemakkelijk toegankelijk en kan veilig worden gebiopteerd, zonder enig verlies van reukvermogen 1. Dienovereenkomstig, de olfactorische slijmvlies biedt een "open venster" in het volwassen menselijk waardoor men kan studeren ontwikkelingsstoornissen (bijv. autisme, schizofrenie), 2-4 of neurodegeneratieve (bijvoorbeeld Parkinson, Alzheimer) ziekten 4,5. Olfactorische mucosa kan worden gebruikt voor zowel vergelijkende moleculaire studies 4,6 of in vitro experimenten op neurogenese 3,7.
Het reukepitheel is ook een zenuwweefsel dat nieuwe neuronen produceren elke dag te vervangen die beschadigd zijn door vervuiling, bacteriële van virale infecties. Deze permanente neurogenese wordt ondersteund door voorlopers, maar ook stamcellen die binnen beide compartimenten van het slijmvlies, namelijk de neuroepithelium en de onderliggende lamina propria 8-10. We hebben onlangs een methode ontwikkeld om de volwassen stamcellen zich in de lamina propria zuiveren en, nadat aangetoond dat ze nauw verbonden zijn met het beenmerg mesenchymale stamcellen (BM-MSC), noemden we ze olfactorische ecto-mesenchymale stamcellen (OE- MSC) 11.
Interessant is dat in vergelijking met de BM-MSC's, OE-MSC's tonen een hoge proliferatie tarief, een verhoogde clonogenicity en een neiging om te differentiëren naar neurale cellen. We hebben voordeel van deze kenmerken studies gewijd aan de nieuwe kandidaat-genen in schizofrenie en de ziekte van Parkinson 4 onthullen uit te voeren. Wij en anderen hebben ook aangetoond dat de OE-MSC's in aanmerking komen voor celtherapie veelbelovend, na een ruggenmerg trauma 12,13, een cochleaire schade 14, of in een diermodellen van de ziekte van Parkinson 15 of 16 geheugenverlies.
In deze studie presenteren we methoden om olfactorische slijmvlies biopsie bij ratten en mensen. Na het verzamelen, is de lamina propria enzymatisch gescheiden van het epitheel en de stamcellen worden gezuiverd met behulp van een enzymatische of een niet-enzymatische methode. Gezuiverde olfactorische stamcellen kunnen dan ofwel die in grote aantallen en opgeslagen in vloeibare stikstof of aangezet tot sferen vorm of gedifferentieerd in neurale cellen. Deze stamcellen kunnen ook worden gebruikt voor vergelijkende omica (genomische, transcriptoom, epigenomisch, proteoom) studies.
De technieken die hier maken het knaagdier-en menselijke reuk slijmvlies een nuttig model voor klinisch onderzoek naar de oorzaken van neurologische en neurodegeneratieve ziekten en als een instrument voor het herstellen van de pathologische of getraumatiseerd hersenen. Het protocol is betrekkelijk eenvoudig en kan gemakkelijk worden uitgevoerd door een ervaren celbioloog. Het slagingspercentage voor de biopsie en de cultuur technieken is hoog.
Kritische stappen
Eventuele wijzigingen
Toekomstige toepassingen
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd financieel ondersteund door ANR (Agence Nationale de la Recherche), AFM (Association Française contre les Myopathie), Feder in PACA en IRME (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l'Encéphale). We dankbaar danken Marie Pierre Blanchard (Jean Roche Instituut) voor haar een efficiënte hulp tijdens time lapse opname.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Collection of olfactory mucosa in rats | ||
DMEM/HAM F12 | Invitrogen | 31331-028 |
Sodium Pentobarbital | ||
Rongeur | FST | |
26 gauge needle | Terumo | NN-2613R |
Forceps | ||
Collection of olfactory mucosa in humans | ||
Rigid endoscope | Karl Storz or Richard Wolf Medical | |
Lidocaine | ||
Epinephrine | ||
Throughcut ethmoid forceps | Karl Storz or Richard Wolf Medical | |
Isolation of olfactory stem cells | ||
Dispase II | Roche | 10 295 825 001 |
Dissecting microscope | ||
Micro spatula | FST | |
Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C9891 |
Ca-free/Mg-free PBS | Invitrogen | 14190-250 |
Fetal calf serum | Invitrogen | 10270098 |
Glass coverslip | Knittel Glaser | 001/35 |
Sphere formation and neuronal differentiation | ||
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P-1274 |
Insulin transferrin selenium (ITS) | Invitrogen | 51500056 |
EGF | R&D Systems | 236-EG |
FGF2 | R&D Systems | 233-FB |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 |
B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 |
Glutamine | Invitrogen | 25030024 |
Glutamate | Sigma-Aldrich |