Wir beschreiben hier eine Methode zur Biopsieentnahme Riechschleimhaut von Ratte und Mensch Nasenhöhlen. Diese Biopsien können entweder für die Identifizierung von molekularen Anomalien bei Schädigungen des Gehirns oder Isolieren multipotente adulte Stammzellen, die für die Zell-Transplantation in Tiermodellen für Hirn-Trauma / Krankheit eingesetzt werden kann genutzt werden
Die Riechschleimhaut in der Nasenhöhle befindet, ist für die Erkennung Gerüche. Es ist auch die einzige Nervengewebe, die zu der äußeren Umgebung ausgesetzt ist und leicht zugänglich in jedem lebenden Individuum. Als Ergebnis ist dieses Gewebe einzigartig für jedermann mit dem Ziel, molekulare Anomalien in der pathologischen Gehirns zu identifizieren oder zu isolieren, adulte Stammzellen für die Zelltherapie.
Molekulare Veränderungen bei Schädigungen des Gehirns sind oft studiert mit Nervengewebe gesammelten Proben post-mortem. Allerdings hat dieses Material zahlreiche Einschränkungen. Im Gegensatz dazu ist die Riechschleimhaut leicht zugänglich und können sicher und ohne jeglichen Verlust des Geruchssinns 1 biopsiert werden. Dementsprechend stellt die Riechschleimhaut eine "offene Fenster" in der erwachsenen Menschen, durch die man studieren kann Entwicklungsstörungen (zB Autismus, Schizophrenie) 2-4 oder neurodegenerative (zB Parkinson, Alzheimer) Erkrankungen 4,5. Riechschleimhaut kann entweder für vergleichende molekulare Untersuchungen 4,6 oder in vitro-Experimenten auf die Neurogenese 3,7 verwendet werden.
Das Riechepithel ist auch ein Nervengewebe, dass neue Nervenzellen produziert jeden Tag, um diejenigen, die durch Umweltverschmutzung geschädigt sind, bakterielle von viralen Infektionen zu ersetzen. Diese permanente Neurogenese wird durch Vorfahren aufrechterhalten, sondern auch Stammzellen mit Wohnsitz innerhalb der beiden Kammern der Schleimhaut, nämlich die Neuroepithel und die zugrunde liegenden Lamina propria 8-10. Wir haben kürzlich eine Methode entwickelt, um die adulten Stammzellen in der Lamina propria befindet reinigen und, nachdem er bewiesen, dass sie eng mit dem Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BM-MSC) verbunden, nannten wir sie olfaktorischen Ekto-mesenchymale Stammzellen (OE- MSC) 11.
Interessanterweise, wenn sie auf BM-MSCs verglichen, zeigen OE-MSCs eine hohe Proliferationsrate, einer erhöhten clonogenicity und eine Neigung zu Nervenzellen differenzieren. Wir nutzten diese Eigenschaften auf Studien gewidmet neue Kandidatengene bei Schizophrenie und Parkinson 4 enthüllen durchzuführen. Wir und andere haben auch gezeigt, dass OE-MSCs sind vielversprechende Kandidaten für Zelltherapie nach einer Rückenmarkstraumata 12,13, ein Cochlea-Schäden 14 oder in einem Tiermodell der Parkinson-Krankheit 15 oder Amnesie 16.
In dieser Studie präsentieren wir Methoden zur Riechschleimhaut bei Ratten und Menschen Biopsie. Nach der Entnahme wird der Lamina propria enzymatisch aus dem Epithel und Stammzellen getrennt werden gereinigt, indem eine enzymatische oder nicht-enzymatische Methode. Gereinigtes olfaktorische Stammzellen können dann entweder in großer Zahl gezüchtet und Querneigung in flüssigem Stickstoff oder veranlasst Sphären Form oder differenziert in neuronale Zellen. Diese Stammzellen können auch für vergleichende omics (genomische, Transkriptom-, epigenomischen-, Proteom-) Studien verwendet werden.
Die hier vorgestellten Verfahren stellen die Nager und die menschliche Riechschleimhaut ein nützliches Modell für die klinische Erforschung der Ursachen von neurologischen und neurodegenerativen Erkrankungen sowie ein Werkzeug für die Reparatur der pathologischen oder traumatisierte Gehirn. Das Protokoll ist relativ einfach und kann leicht durchgeführt werden durch einen erfahrenen Zellbiologe. Die Erfolgsrate für die Biopsie und Kultur Techniken ist hoch.
Kritische Schritte
Mögliche Änderungen
Zukünftige Anwendungen
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde finanziell durch die ANR (Agence nationale de la Recherche), AFM (Association Française contre les Myopathien), FEDER in PACA und Irme (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l'Encéphale) unterstützt. Wir danken danken Marie Pierre Blanchard (Jean Roche-Institut) für ihre effiziente Hilfe bei Zeitraffer Aufnahme.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Collection of olfactory mucosa in rats | ||
DMEM/HAM F12 | Invitrogen | 31331-028 |
Sodium Pentobarbital | ||
Rongeur | FST | |
26 gauge needle | Terumo | NN-2613R |
Forceps | ||
Collection of olfactory mucosa in humans | ||
Rigid endoscope | Karl Storz or Richard Wolf Medical | |
Lidocaine | ||
Epinephrine | ||
Throughcut ethmoid forceps | Karl Storz or Richard Wolf Medical | |
Isolation of olfactory stem cells | ||
Dispase II | Roche | 10 295 825 001 |
Dissecting microscope | ||
Micro spatula | FST | |
Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C9891 |
Ca-free/Mg-free PBS | Invitrogen | 14190-250 |
Fetal calf serum | Invitrogen | 10270098 |
Glass coverslip | Knittel Glaser | 001/35 |
Sphere formation and neuronal differentiation | ||
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P-1274 |
Insulin transferrin selenium (ITS) | Invitrogen | 51500056 |
EGF | R&D Systems | 236-EG |
FGF2 | R&D Systems | 233-FB |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 |
B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 |
Glutamine | Invitrogen | 25030024 |
Glutamate | Sigma-Aldrich |