Estrazione DNA da materiale in paraffina per le analisi genetiche ed epigenetiche

Summary

Questo video dimostra il protocollo per l'estrazione del DNA da fissati in formalina materiale in paraffina. Questa è una di più giorni procedura di sezioni di tessuto in cui sono deparaffinate con xilene, reidratato con etanolo e trattati con proteinasi K per purificare e isolare il DNA per le successive analisi del gene-specifici o genoma.

Abstract

Sviluppo e la progressione della malattia sono caratterizzate da frequenti aberrazioni genetiche ed epigenetiche tra riarrangiamenti cromosomici, gli utili e le perdite numero di copie e la metilazione del DNA. I progressi nella high-throughput, genome-wide tecnologie di profilazione, quali microarray, hanno notevolmente migliorato la nostra capacità di identificare e rilevare queste alterazioni specifiche. Tuttavia, come la tecnologia continua a migliorare, un fattore limitante rimane la qualità del campione e la disponibilità. Inoltre, il follow-up i dati clinici ed esito della malattia sono spesso raccolti anni dopo la raccolta del campione iniziale. I campioni, tipicamente fissati in formalina e paraffina (FFPE), sono conservati in archivi ospedale per gli anni a decenni. DNA può essere efficiente ed efficace recuperato da campioni inclusi in paraffina, se il metodo appropriato di estrazione è applicata. DNA di alta qualità estratto da campioni correttamente conservati e archiviati in grado di supportare analisi quantitative per il confronto di tessuti sani e malati e la generazione di firme genetiche ed epigenetiche ^1. Per estrarre il DNA da campioni inclusi in paraffina, nuclei di tessuto o tessuto microdissezionate sono sottoposti a un trattamento xilene, che dissolve la paraffina dal tessuto, e poi reidratato con una serie di lavaggi etanolo. Proteine ​​ed enzimi dannosi come nucleasi sono successivamente digeriti dalle proteinasi K. L'aggiunta di tampone di lisi, che contiene agenti denaturanti come dodecil solfato di sodio (SDS), facilita la digestione ^2. Gli acidi nucleici sono purificati dal lisato tessuto utilizzando tampone saturi centrifugazione ad alta velocità fenolo e che genera una soluzione bifasica. DNA e RNA rimane nella fase acquosa superiore, mentre le proteine, lipidi e polisaccaridi sono sequestrate in inter-e organico-fasi, rispettivamente. Ritenzione della fase acquosa e ripetuto fenolo genera un campione pulito. A seguito di fenolo, RNasi A è aggiunto per eliminare l'RNA contaminanti. Ulteriori fenolo dopo incubazione con RNase A sono usati per rimuovere qualsiasi enzima rimanenti. L'aggiunta di acetato di sodio e il DNA isopropanolo precipita, e la centrifugazione ad alta velocità è usato per far sedimentare il DNA e facilitare la rimozione isopropanolo. Sali in eccesso derivanti dal precipitazioni possono interferire con le successive saggi enzimatici, ma possono essere rimosse dal DNA di lavaggio con etanolo al 70%, seguita da centrifugazione di ri-pellet il DNA ^3. Il DNA è risospeso in acqua distillata o il buffer di scelta, quantificati e conservati a -20 ° C. DNA purificato può essere successivamente utilizzato in applicazioni a valle che includono, ma non sono limitati a, PCR, ibridazione genomica comparativa serie ⁴ (array CGH), Immunoprecipitazione DNA metilato (MeDIP) e sequenziamento, consentendo un'analisi integrativa di campioni di tessuto / tumore.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. Note procedurali</p><ul><li> Xilene e fenoli sono sostanze chimiche tossiche e devono essere manipolati in un fumehood. Consultare la scheda dati di sicurezza (MSDS) prima dell'uso.</li><lixilene> dissolve in plastica, tubi in polipropilene dovrebbe essere usato come tollerano questi composti.</li><lisuggerimenti> speciali possono essere acquistati che contengono un tappo interno carbone. Questo impedisce lo xilene da sciogliere i componenti in gomma nella pipetta. In alternativa, filtro può essere usato.</li></ul><p class="jove_title"> 2. Paraffina rimozione</p><ol><li> In un fumehood, aggiungere 800 ml di xilene (VWR, CABDH6216-4) per la provetta contenente il campione e posto su una sedia a dondolo agitando delicatamente per 5 a 15 minuti per sciogliere la paraffina.</li><li> Pellet il campione facendo girare alla massima velocità (14.000 giri al minuto o 16 000 xg) in una microcentrifuga per 3 minuti. Rimuovere con attenzione il sopranatante xilene e smaltire in un tubo di polipropilene per smaltire i rifiuti xilene. Fare attenzione a non disturbare il pellet.</li><li> Ripetere le fasi di lavaggio xilene 1 e paraffina 2until è completamente sciolto. Questo di solito richiede 2-3 lavaggi, a seconda delle dimensioni del campione di tessuto. Un campione completamente sciolto apparirà morbida, e talvolta perde la sua integrità strutturale. L'integrità del campione può essere valutata delicatamente con la punta della pipetta.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Etanolo reidratazione</p><ol><li> Aggiungere 800 ml di etanolo al 100% (v / v) di grado biologia molecolare etanolo, vortice, gioca per 3 minuti a 14.000 rpm in microcentrifuga. Rimuovere il surnatante etanolo, facendo attenzione a non disturbare il pellet.</li><li> Aggiungere 800 ml di etanolo al 70% (100% (v / v) di etanolo diluito in acqua distillata (dH₂ O)), vortice, e girare per 3 minuti a 14.000 giri al minuto. Rimuovere con attenzione il sopranatante etanolo.</li><li> Aggiungere 800 ml di etanolo al 50% (100% (v / v) di etanolo diluito in acqua distillata (dH₂ O)), vortice, e girare per 5 minuti a 14.000 giri al minuto. Rimuovere con cura come l'etanolo più possibile pipettando. Fare molta attenzione di disturbare il pellet a questo punto come tessuto completamente reidratato non pellet così come i tessuti disidratati.</li><li> Dopo aver rimosso il supernatante etanolo, asciugare il pellet per 5 minuti, facendo attenzione a non troppo secco.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Tessuto digestione</p><ol><li> Aggiungere 200-500 ml di Lysis Buffer (formula di seguito). Risospendere il pellet con un puntale o un vortice. Sforzo in più a questo punto completamente ri-sospendere il tessuto si tradurrà in una digestione più completa del campione e un rendimento migliore di DNA.</li><li> Incubare campioni a 56 ° C in un bagnomaria o dal blocco di riscaldamento.</li><li> Per i nuclei di tessuto, spike 20 l di proteinasi K (20 mg / ml di soluzione concentrata, Invitrogen, AM2548) mattina e sera.</li><li> Ripetere i passaggi precedenti digestione per 2 a 5 giorni fino a quando il tessuto è completamente sciolto.</li></ol><p class="jove_step"> Lysis Buffer</p<ul><li> 10 mM Tris-HCl pH 8.0</li><li> 100 mM EDTA pH 8.0</li><li> 50 mM NaCl</li><li> 0,5% SDS</li><li> 200 mg / ml di proteinasi K (aggiungere al momento dell'uso)</li></ul><p class="jove_title"> 5. DNA ripulire</p><ol><li> Aggiungi un uguale volume di tampone saturo fenolo (Fisher, BP1750I-400) e mescolare per inversione. Spin per almeno 5 minuti a 14.000 rpm in microcentrifuga.</li><li> Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. Nota l'interfase: c'è un sacco di materiale bianco?</li><li> Ripetere i passaggi 1 e 2 sulla frazione acquosa fino a quando l'interfase è chiaro (di solito 3 o più volte). Eseguire indietro estrazioni * quando l'interfase è fuzzy per aumentare la resa finale.</li><li> Una volta che l'interfase è chiaro, aggiunge un uguale volume di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400) per la frazione estratto acquoso del campione. Mescolare per 5 minuti e poi girare per 5 minuti a 14.000 rpm. Thisreduces residuo fenolo e acuisce ulteriormente l'interfase, facilitando l'estrazione dello strato acquoso</li><li> Rimuovere lo strato acquoso in una nuova provetta e treatwith RNase A a 100 mg / ml per 1 ora a 37 ° C.</li><li> Ripetere i passaggi da 1 a 4 per togliere ogni residuo RNase A e raccogliere la frazione acquosa. Si deve solo bisogno di 1 o 2 passi tampone saturo fenolo come ci dovrebbe essere molto meno proteine ​​per rimuovere rispetto al lisato iniziale.</li></ol><p class="jove_content"> * Per eseguire indietro estrazioni aggiungere 50-100 ml di dH₂ 0 per la provetta contenente l'interfase e la parte organica. Capovolgere la provetta per mescolare, e far girare il campione a 14.000 rpm in una microcentrifuga per 5 minuti. Raccogliere la fase acquosa e aggiungerlo alla estrazione precedentemente acquisite acquosa. Continua indietro estrazioni fino a quando l'interfase è chiara.</p><p class="jove_title"> 6. DNA precipitazioni</p><ol><li> Valutare il volume del vostro strato acquoso raccolti.</li><li> Aggiungi 1 / 10 del volume di 3 M di sodio acetato pH 5.2 e 1 volume di isopropanolo 100% (v / v) di grado biologia molecolare (o 2,5 volumi di etanolo 100%).</li><li> Mescolare bene e mettere in ghiaccio o in congelatore a -20 ° C per 30 minuti o durante la notte.</li><lispin> alla massima velocità (14.000 rpm) a 4 ° C in microcentrifuga per 10 minuti</li><li> Eliminare il supernatante.</li><li> Lavare il pellet con etanolo al 70% del ghiaccio fredda per eliminare i sali indesiderati.</li><li> Risospendere il pellet nel buffer di scelta (di solito dH₂ O).</li></ol><p class="jove_title"> 7. Quantificazione del DNA</p><ol><li> Quantificare la concentrazione del DNA. La A260: A280 rapporto dovrebbe essere ~ 1.8. Per piccole quantità di DNA, la misurazione utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop è preferito.</li><liquantificazione> In seguito, elettroforesi su gel deve essere effettuata per testare la qualità del vostro campione di DNA e RNA stabilire se la contaminazione è stata completamente degradata.</li><li> Alta qualità del DNA estratto è adatto per applicazioni a valle, oppure possono essere conservati a -20 ° C per un uso successivo. Se l'RNA è ancora presente nel campione, ripetere il DNA ripulire e passi precipitazioni, e ri quantificare e qualificare la qualità dei vostri campioni.</li></ol>

Discussion

Tessuti sottoposte a biopsia o asportato chirurgicamente per l'analisi istopatologica e la diagnosi sono spesso fissati in formalina e paraffina (FFPE) per la conservazione a lungo termine. Con il crescente interesse per comprendere le basi genetiche della malattia, la capacità di estrarre DNA da questi campioni rappresenta una preziosa fonte di materiale diagnostico che può essere utilizzato per l'analisi e gli studi di genomica traslazionale. Storicamente campioni FFPE non sono state considerate una valida fonte per l'analisi molecolare degli acidi nucleici possono essere fortemente modificati dagli acidi nucleici e proteine-proteina-proteina reticolazione ^6. Tuttavia, la scoperta che la digestione della proteasi rilascia frammentato acidi nucleici che sono adatti per le analisi a valle tra cui PCR, array CGH, la sequenza e profili di metilazione, consente l'utilizzo di questi esemplari preziosi per l'analisi genetica ^6.

Estrazione del DNA da tessuti inclusi in paraffina è una procedura robusta che si basa sulla solubilità differenziale per purificare il DNA. Qualità del DNA estratto e quantità e il successo di amplificazione del DNA successive dipende da una serie di parametri prima, durante e dopo l'estrazione. Questi includono, ma non solo: tipo e la quantità di tessuto, il tipo di fissativo utilizzati per la conservazione dei tessuti, la durata della fissazione, età del blocco di paraffina e condizioni di conservazione, così come la lunghezza del segmento di DNA desiderato di essere amplificato ^1,7. Rimozione della paraffina dal tessuto è la fase più critica per l'estrazione di successo come paraffina indisciolto porta a scarsa qualità del campione e l'inibizione della PCR.

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
Xylene	VWR	CABDH6216- 4	–
1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes	Sorenson BioScience	11510	–
Spectrafuge 16M Microcentrifuge	Labnet	C0160-B	–
Lysis Buffer	–	–	10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K
Proteinase K Stock Solution	Invitrogen	AM2548	20 mg/ml
Proteinase K Stock Solution
Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9	Fisher	BP1750I-400	–
Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0)	Fisher	BP1752I-400	–
RNase A	Roche	10109169001	100mg
3M sodium Acetate pH 5.2	–	–	40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave
ND 3300 Spectrophotometer	NanoDrop	–	–