Geoptimaliseerd protocol voor Efficiënte Transfectie van dendritische cellen zonder Cell Rijping
Summary
We presenteren onze geoptimaliseerde high-throughput nucleofection protocol als een efficiënte manier transfecteren primaire menselijke monocyt-afgeleide dendritische cellen met een plasmide DNA of siRNA, zonder dat cel rijping. We verder bewijs leveren voor een succesvolle siRNA zwijgen van gerichte gen RIG-I zowel op mRNA-en eiwitniveau.
Abstract
Dendritische cellen (DC's) kan worden beschouwd als schildwachten van het immuunsysteem, die een cruciale rol spelen in de initiatie en reactie op de infectie 1. Detectie van pathogene antigen door naïeve DCs is door middel van patroonherkenning receptoren (PRRS), die in staat zijn om specifieke geconserveerd structuren aangeduid als pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPS) te erkennen. Detectie van PAMPs door DCs triggers een intracellulaire signalisatie cascade resulteert in hun activering en transformatie om te rijpen DCs. Dit proces wordt doorgaans gekenmerkt door de productie van type 1 interferon samen met andere pro-inflammatoire cytokines, opregulatie van celoppervlaktemerkers zoals MHCII en CD86 en de migratie van de volwassen DC om drainerende lymfeklieren, waar de interactie met T-cellen initieert de adaptieve immuunrespons 2, 3. Zo, DC koppeling het aangeboren en adaptieve immuunsysteem.
De mogelijkheid om de moleculaire netwerken die ten grondslag liggen DC naar aanleiding van de verschillende ziekteverwekkers ontleden is cruciaal voor een beter begrip van de regeling van deze signaalwegen en hun geïnduceerde genen. Het moet ook helpen de ontwikkeling van de DC-gebaseerde vaccins tegen infectieziekten en tumoren. Echter, deze lijn van onderzoek ernstig belemmerd door de moeilijkheid van het transfecteren primaire DCs 4.
Virus transductie methoden, zoals het lentivirale-systeem, worden doorgaans gebruikt, maar dragen vele beperkingen, zoals de complexiteit en de bio-gevaarlijk risico (met de daaraan verbonden kosten) 5,6,7,8. Daarnaast is de levering van virale gen-producten verhoogt de immunogeniciteit van de getransduceerde DCs 9,10,11,12. Elektroporatie is gebruikt met gemengde resultaten 13,14,15, maar wij zijn de eersten die het gebruik van een high-throughput transfectie protocol rapport en overtuigend aan te tonen het nut.
In dit rapport vatten we een optimale commerciële protocol voor high-throughput transfectie van menselijke primaire DCs, met een beperkte cel toxiciteit en een afwezigheid van DC rijping 16. Transfectie-efficiëntie (van GFP plasmide) en de levensvatbaarheid van de cellen werden meer dan 50% en 70% respectievelijk. FACS-analyse opgesteld van de afwezigheid van een toename van expressie van de rijping markers CD86 en MHCII in getransfecteerde cellen, terwijl qRT-PCR toonden geen opregulatie van IFNβ. Met behulp van deze elektroporatie protocol, we leveren het bewijs voor een succesvolle transfectie van DCs met siRNA en effectief naar beneden slaan van gerichte gen RIG-I, een belangrijke erkenning virale receptor 16,17, zowel op mRNA-en eiwitniveau.
Protocol
Discussion
Efficiënte transfectie van naïeve primaire dendritische cellen is belangrijk voor de high throughput analyse en reverse engineering van cellulaire inflammatoire paden in deze sleutel cel bemiddelt het aangeboren-adaptieve immuun overgang. Echter, de meeste onderzoekers vinden dat deze cellen zijn moeilijk te efficiënt en zonder de transfectie procedure inducerende celrijping transfecteren wanneer er gebruik wordt standaard transfectie technieken. We hebben onderzocht of deze beperkingen kunnen worden overwonnen door …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het project werd ondersteund door de NIH NIAID Contract No HHSN2662000500021C. Wij danken Ming Chen voor zijn technische bijstand.
Materials
| Equipment/Reagent | Company | Catalogue # | Comments |
|---|---|---|---|
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
Referências
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
- Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
- Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
- Aicher, . Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
- Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
- Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
- Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
- Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
- Roth, . Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
- Tendeloo, V. F. V. a. n. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
- Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
- Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
- Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. , .
- Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
- Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
- Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).
